王雅，馬重華，郭濤，李家寅，周尚臻，何海寧，王曉蘭

1(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730050)2(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州，730050)

杏子果肉多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究*

王雅1，馬重華2，郭濤1，李家寅1，周尚臻1，何海寧1，王曉蘭1

1(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730050)2(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州，730050)

以杏肉多酚為研究對(duì)象，采用超聲輔助提取方法，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝，用還原力和DPPH·清除能力對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。用Design Expert軟件分析確定杏肉多酚適宜提取工藝為:料液比1∶12(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，超聲功率364 W，超聲時(shí)間17 min。在此條件下杏子果肉多酚提取率達(dá)9.39%;4個(gè)因素對(duì)杏肉多酚提取率影響的主次順序?yàn)?超聲功率＞料液比＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間;還原力和DPPH·清除能力表明，杏肉多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但在相同質(zhì)量濃度下，杏肉多酚的抗氧化活性小于Vc。

杏肉，多酚，超聲波輔助提取，響應(yīng)曲面法，抗氧化活性

杏子，又名甜梅、杏，英文為apricot，拉丁語學(xué)名為Prunus armeniaca，為薔薇科李屬李亞屬植物，含有多種生物活性物質(zhì)和人體必需的維生素及無機(jī)鹽類，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的水果［1］。杏肉多酚是杏肉中所含多元酚類物質(zhì)的總稱，研究表明多酚類物質(zhì)在抗氧化、清除自由基、抑菌、抗癌、抗衰老、降血糖、降血脂、預(yù)防心血管疾病等方面具有獨(dú)特的生理功效［2］，目前對(duì)杏肉的開發(fā)應(yīng)用主要在飲料和杏脯的研究上，而對(duì)杏肉多酚的提取及抗氧化活性研究報(bào)道較少，只見到熊素英等［3］和馬景蕃［4］等分別對(duì)小白杏和香白杏多酚化合物的提取及抗氧化功能進(jìn)行了初步研究，因此，本文通過超聲波輔助提取和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了杏肉多酚的提取工藝，并對(duì)純化后的杏肉多酚進(jìn)行了抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 原料

杏(紅玉杏)，2011年6月于購(gòu)于甘肅西太華超市，去核，干燥粉碎，備用。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇(天津市百世化工有限公司)，沒食子酸(Sigma-Aldrich)，Vc(抗壞血酸萊陽市雙雙化工有限公司)，DPPH(二苯代苦味?；杂苫?(Sigma-Aldrich)，NKA-9大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠)。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-Ⅱ)，寧波新芝生物科技股份有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-9200)，北京瑞利分析儀器公司;真空冷凍干燥機(jī)(FD-1-55)，北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［5－6］

用5 mL乙醇溶解0.2 500 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水定容至50 mL。分別移取 0、0.5、1.0、1 .5、2.5 mL沒食子酸溶液到50 mL容量瓶中，用去離子水定容，配制成質(zhì)量濃度為 0、50、100、150、250 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。從上述不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1 mL，加入到50 mL比色管中。加入2.5 mL Folin-C試劑，混合。在0.5～8 min內(nèi)加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉溶液，混合，用去離子水定容至1 000 mL。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在20℃放置1 h后，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在最大吸收峰下測(cè)定吸光度，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度值Y與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X(mg/mL)之間的回歸關(guān)系為:Y=3.130 3X +0.0163，R2=0.996 7。

2.2 杏肉多酚的提取和測(cè)定

稱取2.000 g杏肉，加入一定濃度的乙醇溶液浸泡0.5 h，以一定的料液比和超聲功率超聲一定時(shí)間，離心，取上清液減壓濃縮，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)其吸光度，計(jì)算多酚的提取率，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化杏肉多酚提取工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken［7－9］設(shè)計(jì)方案，以料液比(a)、乙醇濃度

(b)、超聲功率(c)和超聲時(shí)間(d)，并以 +1、0、－1分別代表變量的水平，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化杏肉多酚提取工藝的因素與水平

2.4 杏肉多酚的制備

將杏肉多酚提取液離心后減壓濃縮，經(jīng)NKA-9大孔樹脂純化，用不同濃度的乙醇溶液洗脫后，減壓濃縮，真空冷凍干燥后測(cè)其純度為77.32%。

2.5 杏肉多酚的抗氧化性能測(cè)定

2.5.1 還原能力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法評(píng)價(jià)杏肉多酚還原能力［5］。在不同濃度的沙米綠原酸溶液中加入2.5 mL(0.2 mol/L pH=6.6)的磷酸鹽緩沖液，加入2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀，混勻，50℃恒溫20 min，加2.5 mL 100 g/L三氯乙酸，離心(3 000 r/min)10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水，加0.5 mL 1 g/L三氯化鐵，于700 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。用對(duì)應(yīng)濃度的Vc作還原能力比較試驗(yàn)。

2.5.2 對(duì)DPPH自由基清除能力［10－12］

待測(cè)液的制備:配制質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液，再分別配制質(zhì)量濃度為0.000 2、0.000 4、0.000 6、0.000 8、0.001、0.002、0.003和0.003 5 mg/mL的杏肉多酚溶液。

對(duì)DPPH溶液進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為517 nm。以無水乙醇為對(duì)照，精確吸取DPPH溶液2.5 mL，與2.5 mL無水乙醇混合，以無水乙醇為對(duì)照，測(cè)定溶液在517 nm處的吸光度值(A0)。

精確吸取上述不同濃度的杏肉多酚溶液2.5 mL，分別與質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL DPPH溶液2.5 mL混合，搖勻后放置30 min。以無水乙醇為對(duì)照，測(cè)定上述溶液在517 nm處的吸光度值(Ai)。

精確吸取上述不同濃度的杏肉多酚溶液2.5 mL，分別與2.5 mL無水乙醇混合均勻，以無水乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517 nm處的吸光度值(Aj)，計(jì)算清除率。得到清除率在一定濃度范圍的回歸方程，通過線性方程計(jì)算IC50(DPPH清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣液濃度)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)杏肉多酚提取率的影響

在超聲時(shí)間15 min、超聲功率320 W、乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%，分別用 1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20的料液比提取，以考察料液比對(duì)杏肉多酚提取率的影響。圖1表明，隨料液比的增大，多酚提取率不斷增大，在料液比為1∶12時(shí)多酚提取率達(dá)最高，之后隨料液比的增大多酚提取率降低，另外，料液比增大，會(huì)增大提取成本，因此，取最佳料液比為1∶12。

圖1 料液比對(duì)多酚提取率的影響

3.1.2 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

在超聲時(shí)間15 min、超聲功率320 W、料液比1∶12，選取不同體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的乙醇提取。圖2表明，隨乙醇濃度的增加，杏肉多酚提取率不斷增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，杏肉多酚的提取率最大。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

3.1.3 超聲功率對(duì)杏肉多酚提取率的影響

在超聲時(shí)間15 min、料液比1∶12、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù) 70%，分別用 80、160、240、320、400 W 的超聲功率提取。圖3表明，隨超聲功率的增加，多酚提取率不斷增加，當(dāng)超聲功率達(dá)到320 W時(shí)，多酚的提取率達(dá)到了最大，超聲功率繼續(xù)增大，多酚的提取率反而下降，可能是較大的超聲功率會(huì)破壞部分多酚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其含量下降，因此，最佳超聲功率為320 W。

圖3 超聲功率對(duì)多酚提取率的影響

3.1.4 超聲時(shí)間對(duì)杏肉多酚提取率的影響

在超聲功率320 W、料液比1∶12、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，分別用 5、10、15、20、25、30 min 的超聲時(shí)間提取。圖4表明，隨超聲時(shí)間的增加，多酚提取率不斷增大;當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，多酚的提取率達(dá)到最大，之后隨時(shí)間的增加，可能是部分多酚被氧化而使提取率下降，另外，超聲時(shí)間越長(zhǎng)能耗越大，因此，最佳超聲時(shí)間為15 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

3.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑴c顯著性檢驗(yàn)

3.2.1 回歸模型的建立及統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)響應(yīng)曲面優(yōu)化

設(shè)計(jì)并優(yōu)化的29組試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果見表2，采用軟件Design-Expert 7.1.4對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3、表4。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明模型差異極顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.900 9，說明用該模型可以解釋90.09%響應(yīng)值的變化。該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)杏肉多酚提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表4可知，二次項(xiàng)a2和b2對(duì)多酚提取率的影響極顯著，二次項(xiàng)d2和交互項(xiàng)ab對(duì)多酚提取率的影響高度顯著，一次項(xiàng)a、c，二次項(xiàng)c2和交互項(xiàng)ac、ad對(duì)多酚提取率的影響顯著。依據(jù)參數(shù)估計(jì)值知影響因子的主效應(yīng)順序:超聲功率＞料液比＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)的數(shù)值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其等于零，得如下方程:

0.13 －0.9A+0.34B－0.28C－0.27D=0(1)

0.09 +0.34A－1.08B－0.022C+0.15D=0(2)

0.15 +0.28A－0.022B－0.36C+0.2D=0(3)

0.074 －0.27A+0.15B+0.2C－0.56D=0(4)

解得A=－0.114;B =0.093;C=0.549;D=0.408，代入編碼公式得多酚提取的最佳工藝:a(料液比)=1∶11.77 g/mL;b(乙醇濃度)=70.93%;c(超聲功率)=363.92 W;d(超聲時(shí)間)=17.04 min。

3.2.2 模型驗(yàn)證

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，超聲波輔助提取杏肉多酚的最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶12 g/mL，乙醇濃度71%，超聲功率364 W，超聲時(shí)間17 min。在此條件下杏肉多酚理論提取含量為9.36%，實(shí)際杏肉多酚提取含量為9.39%，兩者非常接近，說明該模型可靠。

圖5顯示，當(dāng)料液比為1∶12，超聲功率為320 W時(shí)，乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)杏肉多酚提取率的交互作用。當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，杏肉多酚提取率提高，但超聲時(shí)間超過一定值時(shí)，杏肉多酚的提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，杏肉多酚提取率隨乙醇濃度的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)。

圖5 乙醇濃度及超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率交互作用的等高線圖及響應(yīng)面

圖6 顯示當(dāng)超聲時(shí)間為15 min，超聲功率為320 W時(shí)，料液比和乙醇濃度對(duì)杏肉多酚提取率的交互作用。當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，隨著料液比的增大，杏肉多酚提取率提高，但料液比超過一定值時(shí)，杏肉多酚的提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)料液比一定時(shí)，杏肉多酚提取率隨乙醇濃度的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)。

圖6 料液比及乙醇濃度對(duì)多酚提取率交互作用的等高線圖及響應(yīng)面

圖7 顯示，當(dāng)乙醇濃度為70%，超聲功率為320 W時(shí)，料液比和超聲時(shí)間對(duì)杏肉多酚提取率的交互作用。當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，杏肉多酚提取率提高，但超聲時(shí)間超過一定值時(shí)，杏肉多酚的提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，杏肉多酚提取率隨料液比的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)。

圖7 料液比及超聲時(shí)間對(duì)多酚含量交互作用的等高線圖及響應(yīng)面

3.3 杏肉多酚的抗氧化活性

3.3.1 還原力

由圖8可知，杏肉多酚的還原力隨質(zhì)量濃度的增大而增大，且相同質(zhì)量濃度下杏肉多酚的還原力小于Vc。通常情況下，樣品的還原力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，其還原力越強(qiáng)，則物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)，說明杏肉多酚的抗氧化性小于Vc。

圖8 杏肉多酚與VC還原力的比較

3.3.2 杏肉多酚清除DPPH·的能力

通過圖9可知，隨著濃度的增大，杏肉多酚清除DPPH·的能力逐漸增強(qiáng)，在相同質(zhì)量濃度下，杏肉多酚清除DPPH·的能力低于Vc。由表5可知，杏肉多酚的IC50大于Vc的IC50，說明其對(duì)DPPH·的清除能力比Vc弱，即杏肉多酚的抗氧化性小于Vc。

圖9 杏肉多酚和VC清除DPPH·能力

表5 杏肉多酚和Vc的IC50值比較

4 結(jié)論

(1)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法可知杏肉多酚的最佳提取條件為:料液比1∶12(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，超聲功率364 W，超聲時(shí)間17 min。在此條件下杏肉多酚理論提取含量為9.36%，在此條件下杏肉多酚理論最大提取率為9.36%，實(shí)際最大提取率為9.39%;影響杏肉多酚超聲波輔助提取的主次因素順序?yàn)槌暪β剩玖弦罕龋疽掖紳舛龋境晻r(shí)間。

(2)體外抗氧化試驗(yàn)研究表明:杏肉多酚有較強(qiáng)的還原力和清除DPPH·的能力，說明杏肉多酚具有一定的抗氧化活性，但在相同質(zhì)量濃度下杏肉多酚的抗氧化活性弱于Vc。

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Optimization of Polyphenol Ultrasonic Assisted Extraltion from Apricot Pulp and Its Antioxidant Activities

Wang Ya1，Ma Chong-hua2，Guo Tao1，Li Jia-yin1，Zhou Shang-zhen1，He Hai-ning1，Wang Xiao-lan1
1(College of life science and engineering，Lanzhou university of Technology ，Lanzhou 730050，China)2(College of Petrochemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China)

The ultrasonic assisted extraction technology of apricot pulp polyphenol was studied.The optimal conditions were determined by mono－factor experiment and response surface analysis.The antioxidant activity of apricot pulp polyphenol was studied by using reducing power and clearance ability for DPPH?.The result indicated that the optimum extracting conditions of apricot pulp polyphenol were as follows:the ratio of solid to liquid 1∶12，concentration of ethanol 71%，the ultrasonic power 364w and the extraction time 17 min.under the above extracting conditions，the extraction rate of apricot pulp polyphenol was 9.39% .The influence effect of four factors to the extraction rate of apricot pulp polyphenol were ultrasonic power＞ liquid ratio＞ concentration of ethanol＞ ultrasonic time.The apricot pulp polyphenol had strong antioxidative activity.However，its antioxidative activity was lower than Vc in the same concentrations.

Canarium album ( Lour． ) Rauesch，phenolic extracts，antioxidant capacity

博士研究生，副教授(郭濤為通訊作者)。

*杏仁產(chǎn)品的研發(fā)與綜合利用(H1008cc003)，蘭州理工大學(xué)“學(xué)科協(xié)調(diào)發(fā)展計(jì)劃”現(xiàn)代生物藥物合成藥物的研究與開發(fā)資助

2011－07－25，改回日期:2011－1025－