龔 艷，胡清華，鐘 華，梁 霄，羅小林，何 芳

（1石河子大學醫(yī)學院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002；2華中科技大學同濟醫(yī)學院／衛(wèi)生部呼吸系疾病重點實驗室，武漢430030）

小凹蛋白－1和細胞外鈣敏感受體在人臍靜脈內(nèi)皮細胞小凹共定位研究

龔 艷1，胡清華2，鐘 華1，梁 霄1，羅小林1，何 芳1

（1石河子大學醫(yī)學院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002；2華中科技大學同濟醫(yī)學院／衛(wèi)生部呼吸系疾病重點實驗室，武漢430030）

前期研究發(fā)現(xiàn)小凹蛋白－1（caveolin－1，Cav－1）和細胞外鈣敏感受體（extracellular Ca2＋－sensing receptor，Ca R）在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（hu man u mbilical vein endothelial cells，HUVECs）膜上有共定位，且Cav－1下調(diào)Ca R介導的鈣內(nèi)流。本實驗探討HUVECs中Cav－1與Ca R的亞細胞定位，可為進一步機制研究提供理論依據(jù)。以3～4代HUVECs隨機分為2組：（1）對照組；（2）甲基－β－環(huán)糊精（MβCD）處理組，分別采用蔗糖密度梯度離心和 Western blot技術提取含小凹膜碎片和檢測Cav－1和Ca R蛋白的表達。結果顯示，（1）MβCD處理組HUVECs細胞中Cav－1和Ca R蛋白的表達與對照組相比無差異（P＞0.05）。（2）MβCD處理組小凹區(qū)Cav－1和Ca R蛋白的表達低于對照組（P＜0.05）。由此可知，Cav－1和Ca R蛋白共定位于HUVECs的小凹區(qū)，MβCD可抑制兩者在小凹的共定位。

蔗糖密度梯度離心；甲基－β－環(huán)糊精；小凹蛋白－1；細胞外鈣敏感受體

血管內(nèi)皮細胞持續(xù)鈣離子內(nèi)流以維持細胞內(nèi)鈣離子濃度是細胞執(zhí)行功能所必須的。細胞外鈣敏感受體（Extracellular Ca2＋－sensing Receptor，Ca R）是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度的重要受體蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C亞族的成員，其基本結構與一般G蛋白偶聯(lián)受體相同，在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)血管張力方面起著重要的作用。小凹蛋白－1（Caveolin－1，Cav－1）是小凹（Caveolae）表面的標志蛋白和結構蛋白，已在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Hu man Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）證實Ca R和Cav－1共定位于胞膜，且Cav－1對Ca R介導的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用［1－2］。為進一步探討其機制，本研究擬在現(xiàn)有工作基礎上，分別采用蔗糖密度梯度離心法和 Western blot技術提取含Cav－1膜碎片（即Caveolae）和檢測Cav－1 Ca R蛋白在HUVECs的亞細胞定位。

1 材料與方法

1.1 材料

健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶，性別、體重不限（來自華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會批準和個人知情同意）；甲基－β－環(huán)糊精（methyl－β－cyelodextrin，MβCD）（Sig ma）；抑肽酶（Aprotinin）（Sig ma）；M199（Ther mo）；ECM（Sciencellg）；胎牛血清（Gibco）；明膠（Sig ma）；Cocktail（CALBIOCHEM 公 司）；Cav－1 一 抗 （cell signaling）；Ca R 一 抗 （Affinity Bio Reagents，ABR）；GAPDH（博 奧 森）；HRP Conjugated Goat anti－Mouse Ig G h＋1（Invitrogen公司）；HRP Conj ugated Goat anti－Rabbit Ig G h＋1（Invitr ogen公司）；ECL發(fā)光試劑盒（Ther mo）；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs原代培養(yǎng)

依據(jù)本研究室以前的方法培養(yǎng)HUVEC［1］，并對其進行細胞形態(tài)學及對細胞內(nèi)Ⅷ因子進行免疫細胞化學染色鑒定是否為HUVEC。取2～5代細胞用于實驗。

1.2.2 Western blot檢測 MβCD處理后 HUVECs中Cav－1和CaR蛋白表達

正常細胞和用MβCD預孵育30 min后的HUVECs，分別棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS沖洗2～3遍后，加入含有Cocktail的裂解液，細胞刮刀刮下貼壁細胞，將黏稠狀細胞裂解產(chǎn)物收集于eppendorf管中。冰浴中靜置30 min～60 min，12 000 r／min，4℃，離心5 min。將上清移入另一eppendorf管中，棄去沉淀。BCA方法蛋白定量。樣品加入加樣緩沖液，沸水煮5 min，SDS－PAGE電泳分離蛋白，電轉至醋酸纖維素膜（NC膜）上，室溫下用5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h。分別加入Cav－1的一抗和Ca R的一抗，4℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗膜3次各15 min，加入相應的二抗搖床上孵育1 h，TBST洗膜3次各20 min；ECL化學發(fā)光試劑顯色，顯影定影，獲得實驗結果。

1.2.3 蔗糖密度梯度離心法提取Caveolae并檢測Cav－1與Ca R蛋白在Caveolae表達及兩者共定位

非連續(xù)蔗糖密度梯度離心法用于制備含Caveolae膜碎片［3－4］，所有步驟均在冰上操作。收集約5×107個細胞，用1 ml裂解緩沖液懸浮，裂解緩沖液成分：1%Triton X－100，5 mmol／L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA），1 mmol／L MNa3VO4，1 mmol／L 氟代 甲烷苯磺酸，75 U抑肽酶；實驗中用Caveolae結構破壞劑2 mmol／L MβCD 處理細胞［5］，細胞超聲破碎儀破碎細胞2 s、5次，將細胞裂解物與相同體積的85%蔗糖混合，放入離心管底部，依次加入45%，30%，20%，10%，5%的蔗糖溶液，4℃，超速離心200 000 g，18 h，依次吸出離心條帶，每次1 mL，共可獲得12個樣本，其中從上往下第6個樣本為白色絮狀的分層，取出的各區(qū)段樣本經(jīng)SDS－PAGE電泳，用Wester n blot檢測Caveolae的標志蛋白Cav－1及是否與Ca R共定位與同一Caveolae區(qū)。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，均數(shù)間的比較采用t檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同處理方法后HUVECs中Cav－1和Ca R蛋白表達

用MβCD預孵育HUVECs 30 min后提蛋白，Wester n blot檢測Ca R及Cav－1蛋白表達的結果見圖1a。其中Ca R蛋白表達在對照組與MβCD處理組分別為0.77±0.01，0.75±0.01；Cav－1分別為1.88±0.01和1.84±0.01，兩組間 Ca R 和 Cav－1蛋白表達均無差異（P＞0.05）（圖1b）。

圖1 不同處理組HUVECs中Cav－1和CaR蛋白的表達Fig.1 The expression of Cav－1 protein and Ca R protein in HUVECs

2.2 蔗糖梯度密度離心法提Caveolae后Western blot檢測Cav－1和Ca R蛋白表達及兩者共定位

細胞裂解物經(jīng)蔗糖密度梯度離心后用無菌注射器按體積共抽取12個樣本，在離心管中間，20%與30%蔗糖濃度交界處出現(xiàn)一個白色絮狀物的分層，此白色絮狀分層在第6個樣本區(qū)，并在此樣本中采用Western blot技術檢測到Caveolae的標志蛋白Cav－1，同時也檢測到Ca R的表達（圖2a）；其中Ca R蛋白表達在第6個樣本對照組與MβCD處理組分別為1和0.57±0.03；Cav－1分別為1和0.69±0.04，MβCD處理組Ca R和Cav－1蛋白表達均低于對照組（P＜0.05）（圖2b）。

圖2 不同處理組第6個樣本Cav－1和CaR蛋白的表達水平Fig.2 The expression of Cav－1 protein and Ca R protein in No.6

3 討論

Ca2＋是細胞內(nèi)重要的信號轉導成分，在神經(jīng)肌肉興奮、細胞生長分化等過程中發(fā)揮重要作用。Ca R是介導內(nèi)Ca2＋釋放和外Ca2＋內(nèi)流的受體之一，其作用可由G蛋白α亞基介導，但也與Ca R相互作用的蛋白有關，Cav－1是與Ca R相互作用的蛋白之一［6］，在某些組織或細胞證實了Cav－1通過與Ca R或其它鈣通道蛋白相互作用在調(diào)節(jié)Ca2＋內(nèi)流中發(fā)揮重要作用。Jung等［7］在培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞株（Saos－2）證實Ca R和Cav－1形成復合物并共定位于胞膜，Cav－1可調(diào)節(jié)Ca R的功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HUVECs有Ca R和Cav－1表達，用免疫熒光技術檢測在HUVECs中Cav－1和Ca R共定位于胞膜，Cav－1對Ca R介導的Ca2＋內(nèi)流有下調(diào)作用［1－2］，其機制尚不清楚。

Caveolae是細胞表面特異性內(nèi)陷結構，是細胞信號傳導中心，與信號傳導有關的受體、激酶等在Caveolae區(qū)域高度富集［8］，而 Cav－1又是 Caveolae的表面標志蛋白和結構蛋白，我們設想在HUVECs中Ca R與Cav－1在共定位于Caveolae區(qū)可能是Cav－1下調(diào)Ca R功能的機制之一。，為初步驗證此假設，在本研究中，首先采用蔗糖密度梯度離心的方法處理細胞，最后每組收集到12個樣本，其中從上往下第6個樣本為白色絮狀分層，在第6個樣本區(qū)檢測到高表達的Caveolae標志蛋白Cav－1，證實為Caveolae所在區(qū)域，同時Ca R此樣本中也有較高表達，說明Cav－1和Ca R共定位于同一Caveolae區(qū)；而用Caveolae結構破壞劑MβCD處理細胞（膽固醇和磷脂是Caveolae發(fā)揮重要功能的脂質(zhì)成分，MβCD能破壞膽固醇和磷脂，從而影響Caveolae功能，但對細胞膜的完整性無影響）后發(fā)現(xiàn)，Cav－1和Ca R的在HUVECs中表達沒有改變，但在Caveolae區(qū)兩者的表達均降低。該結果提示MβCD處理破壞Caveolaee結構，并不影響Ca R與Cav－1蛋白的表達水平，Cav－1可能是Ca R定位于Caveolae區(qū)重要的調(diào)節(jié)蛋白。Cav－1并非是很強的可調(diào)節(jié)蛋白［4］，Cav－1的表達直接與膜上Caveolae數(shù)目相關，所以MβCD可能是通過破壞膽固醇和磷脂，減少了細胞膜上Caveolae的數(shù)目使Cav－1的表達降低，從而抑制了兩者在同一Caveolae區(qū)的共定位。

總之，我們研究初步證實Ca R與Cav－1蛋白共定位于同一Caveolae區(qū)，MβCD。在抑制Cav－1表達的同時可影響Ca R和Cav－1亞細胞定位，兩蛋白其它功能上的聯(lián)系還有待進一步探查，該研究結果不僅對深入了解在血管系統(tǒng)中Cav－1調(diào)節(jié)Ca R功能的生理和病理生理作用機制有重要意義，還能為臨床疾病防治提供一條新思路。

［1］王振煥，鐘華，何芳，等.小凹蛋白－1和鈣受體在人的臍靜脈內(nèi)皮細胞的表達［J］.石河子大學學報：自然科學版，2010，28（2）：194－198.

［2］王振煥，胡清華，何芳，等.小凹蛋白－1下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞外鈣敏感受體介導的鈣內(nèi)流［J］.生理學報，2011，63（1）：39－47

［3］Ledes ma M D，Abad－Rodriguez J，Galvan C，et al.Raft disor ganization leads to reduced plasmin activity in Alzhei mer’S disease brains［J］.EMBO Rep，2003，4（12）：1190－1196.

［4］Meye C，Schumann J，Wagner A，et al.Effects of homocysteine on the levels of caveolin－1 and e NOS incaveolae of hu man coronary artery endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2007，190（2）：256－263.

［5］Fehx E，Tho mas SN，Leonar d JF，et al.Proteomic analysis of glycosyl phosphat－idylinositol－anchored membrane proteins［J］.Mol Cell Pr oteo mics，2003，2（12）：1261－1270.

［6］Huang C，Miller R T.The calciu m－sensing receptor and its interacting proteins［J］.J Cell Mol Med，2007，11（5）：923－934.

［7］Jung S Y，Kwak J O，Ki m H W，et al.Calciu m sensing receptor for ms complex with and is up－regulated by caveolin－1 in cult ured hu man osteosarco ma （Saos－2）cells［J］.Exp Mol Med，2005，37（2）：91－100.

［8］Liu P，Rudick M，Andson R G.Mutiple f unctions of caveolin－1［J］.J Biol Chem，2002，277（44）：41295－41298.

Co－localization of Caveolin－1 and Extracellular Ca2＋－sensing Receptor in Caveolae in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

GONG Yan1，HU Qinghua2，ZHONG Hua1，LIANG Xiao1，LUO Xiaoling1，HE Fang1
（1 Medical College of Shihezi University／Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi，832002，China；2 Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology／Key Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China，Wuhan 430030，China）

Our previous results demonstrated that extracellular Ca2＋－sensing receptor（Ca R）and caveolin－1（Cav－1）co－localized on the plasma localization of Cav－1 and CaRin HUVECs，which provide a theoretical basis for further functional studies.Methods：The thirdor fourth passage of HUVECs were randomly divided into two groups：（1）Control group；（2）methyl－β－cyelodextrin（MβCD）group.We isolated caveolae－enriched membrane fractions from MβCD－treated HUVECs by Triton X－100 sucrose density gradient fractionation and detected the expressions of Cav－1 and Ca R protein by Wester n blot，respectively.Results：（1）The expression of Cav－1 and Ca R proteins bet ween control group and MβCD group was no difference（P＞0.05）.（2）The expressions of Cav－1 and Ca R proteins in caveolae after MβCD treated was significantly reduced（P＜0.05）.Conclusion：The present st udy suggests that Ca R and Cav－1 co－localize in caveolae in HUVECS，MβCD reduces the co－localization of Cav－1 and Ca R in caveolae.

sucrose density gradient centrifugation；MβCD；caveolin－1；extracellular Ca2＋－sensing receptor

何芳（1964－），女，教授，主要從事心血管病理生理研究；e－mail：fangf2002shz＠126.co m。

R363.2＋1

A

1007－7383（2011）03－0305－04

2011－01－20

國家自然科學基金項目（30860099）

龔艷（1985－），女，碩士生，專業(yè)方向為心血管病理生理。