何擴(kuò)，張秀媛，袁永俊

（1.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北 張家口 075131；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

超濾法純化酪蛋白凝乳酶水解物中的酪蛋白糖巨肽

何擴(kuò)1，張秀媛1，袁永俊2

（1.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北 張家口 075131；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

研究超濾法分離純化了（CGMP）的條件，得到超濾的最佳條件是在室溫下，壓差為0.02 MPa，濃縮比為8。通過(guò)此方法得到比較純的CGMP，蛋白回收率為1.77%，糖基化程度（唾液酸/蛋白質(zhì)）為70.1 μg/mg，并且此方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

酪蛋白糖巨肽；超濾；唾液酸

酪蛋白糖巨肽（CGMP）是蛋白酶酶解κ-酪蛋白得到的C末端親水性糖肽，其獨(dú)特的氨基酸組成和含有豐富的唾液酸使其具有多種生理功能，如能抑制胃分泌物；能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)；能抑制病原體包括病毒和細(xì)菌等黏附至細(xì)胞；能結(jié)合霍亂和埃希氏大腸桿菌的腸毒素等。除此之外，CGMP還是苯丙酮尿患者膳食中的首選成分，并且在控制肝病方面也有成效[1-2]。有人對(duì)沉淀法和離子交換樹(shù)脂分離純化胃蛋白酶水解酪蛋白的水解物制備CGMP的條件進(jìn)行了研究[3-4]。本文對(duì)超濾法分離純化凝乳酶水解酪蛋白的水解物制備CGMP的條件進(jìn)行了研究，此方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪素（BR）、間苯二酚（AR）、考馬斯亮藍(lán)G-250（BR）、醋酸銨（AR）：成都市科龍化工試劑廠；凝乳酶（1:100000）：上海阿敏生物技術(shù)有限公司；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC）；牛血清白蛋白（BR）：上海伯奧生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PES-200超濾膜（切割分子量20000 u，有效過(guò)濾面積0.6 m2）、SMB-20型超濾裝置：中科院上海原子核研究所；ZT60-600a型蠕動(dòng)泵：保定蘭格恒流泵有限公司；Superdex 7510/300 GL、AKTA purifier：Amersham Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白水解液的制備及其初步分離[5]

酪蛋白濃度為10 mg/mL，凝乳酶/底物為0.6/100，溫度為40℃，pH為6.6條件下，水解2.5 h后，調(diào)pH為8～8.5，在75℃水浴保溫30 min終止反應(yīng)，冷卻后調(diào)pH為4.6，真空抽濾除去沉淀，并用一定量水洗滌沉淀，合并上清液和洗滌液調(diào)pH為7.0，即得到酪蛋白水解液，微濾后備用。

1.2.2 超濾工藝流程

1.2.3 超濾分離指標(biāo)[6]

1.2.3.1 滲透通量J

單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積的滲透液的體積，單位通常用L/（m2·h）。本試驗(yàn)只用到了一種PES-200超濾膜，有效濾膜面積恒定，為了方便，用單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)膜的滲透液體積表示通量，單位為mL/min。

1.2.3.2 滲透通量衰減率

達(dá)到濃縮效果時(shí)滲透通量與初始滲透通量之差與初始滲透通量之比。

1.2.3.3 濃縮比

最初進(jìn)料液體積與超濾過(guò)程中任意時(shí)間的濃縮液體積的比率。

1.2.4 超濾條件的選擇

在室溫下，研究超濾壓差對(duì)滲透通量的影響、滲透通量衰減曲線(xiàn)和濃縮比對(duì)超濾性能的影響。

1.2.5 唾液酸含量的測(cè)定

采用間苯二酚-鹽酸法[5]。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾壓差對(duì)滲透通量的影響

本試驗(yàn)中壓差由泵的蠕動(dòng)提供，考慮到泵的極限轉(zhuǎn)速，測(cè)定了 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 MPa 不同壓差下濾液通量的變化，見(jiàn)圖2。

由圖2可知，壓差較小時(shí)，料液透過(guò)平均通量隨壓差的增加而增加較快，當(dāng)壓差達(dá)到0.02 MPa時(shí)，料液透過(guò)平均通量隨壓差增加變得增加緩慢，這符合超濾過(guò)程中濃差極化和凝膠層理論[8]。在低壓范圍內(nèi)，壓差的增加使小分子物質(zhì)以很快的速度透過(guò)膜，而隨著壓差增大過(guò)程中，污染層被壓實(shí)，濃差極化加劇，使膜污染加快，使透過(guò)速度增加緩慢。綜合考慮選擇0.02MPa作為超濾過(guò)程的壓差。

2.2 滲透通量衰減曲線(xiàn)

研究了單級(jí)間歇操作中，在一定壓力差下，2000mL酶解液隨著滲透液體積的增加，膜平均通量的變化，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，滲透通量變化基本上分為了兩個(gè)階段，即快速下降區(qū)和緩慢減少區(qū)。在開(kāi)始滲透通量下降較快，當(dāng)滲透液量達(dá)到300 mL時(shí)，滲透通量下降變得緩慢，說(shuō)明開(kāi)始濃差極化顯著，當(dāng)滲透液量達(dá)到300mL時(shí)，濃差極化基本上達(dá)到穩(wěn)態(tài)。理論上在濃差極化層處于穩(wěn)態(tài)，在未造成膜孔堵塞，也沒(méi)形成不可逆覆蓋層情況下，滲透通量應(yīng)該會(huì)保持穩(wěn)定，但是在實(shí)際操作過(guò)程中膜的污染是不可避免的，且會(huì)逐漸加重，滲透通量也必定會(huì)下降。

2.3 濃縮比對(duì)超濾性能的影響

采用單級(jí)間歇操作，考察對(duì)2000 mL酶解液分別濃縮2、5、8、10倍不同情況下蛋白質(zhì)的回收率（濃縮液中蛋白質(zhì)總含量與酶解前底物中蛋白質(zhì)總含量之比）、通量衰減率、小分子的除去情況（用Superdex 7510/300 GL測(cè)定，洗脫液為0.1 mol/L醋酸銨，洗脫流速為0.5 mL/min、上樣體積為 0.5 mL，檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm[9]。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到11 mL～14 mL收集組分是CGMP）。

表1 不同濃縮比的超濾結(jié)果Table1 Ultrafiltration result of different volume concentration ratio

由表1和圖4～圖7可知，小分子物質(zhì)隨著濃縮比的增加越來(lái)越少，直到濃縮比為8倍時(shí)，如果繼續(xù)濃縮小分子物質(zhì)沒(méi)有明顯的減少，而蛋白回收率隨著濃縮比的增大在減少，滲透通量衰減率隨著濃縮比的增大在增加?？紤]到對(duì)膜的保護(hù)和目標(biāo)物的回收率，選擇濃縮比為8。

3 結(jié)論

在室溫下對(duì)超濾技術(shù)分離純化CGMP的條件進(jìn)行研究，得到超濾最佳條件是壓差為0.02 MPa，濃縮比為8。通過(guò)此方法得到了比較純的的CGMP，蛋白回收率為1.77%，糖基化程度（唾液酸/蛋白質(zhì)）為70.1μg/mg，并且此方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]高志芳,錢(qián)方,陳莉,等.酪蛋白糖巨肽的生理功能及發(fā)展前景[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2007,28(3):183-185

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[4]劉劍虹,龐廣昌.采用鹽析及Q Sepharose FF分離純化酪蛋白胃蛋白酶水解物中的酪蛋白糖巨肽[J].食品科學(xué),2005,26(8):255-259

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Purifing Casein Glycomacropeptide from Chymosin Casein Hydrolysate by Ultrafiltration

HE Kuo1,ZHANG Xiu-yuan1,YUAN Yong-jun2
（1.Department of Food Science,Hebei North College，Zhangjiakou 075131，Hebei,China;2.College of Biological Engineerring,Xihua University,Chengdu 610039,Sichuan,China）

Ultrafiltration conditions with purifing CGMP were studied.Optimum ultrafiltration conditions were gained as follows:differential pressure 0.02 MPa,concentration ratio 8.The way not only prepares more pure CGMP，the rate of recovery of protein 1.08%,the degree of glycosylation（sialic acid／protein）78.9 μg/mg,but also fit for industrialized production.

Casein glycomacropeptide（CGMP）；ultrafiltration；sialic acid

四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目（07205007）

何擴(kuò)（1978—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

2009-05-22