馬宏偉 ，王聰 ，胡立新 ，*

（1.內(nèi)蒙古蒙牛阿拉乳制品有限責(zé)任公司，北京 101107；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430068）

低溫β-半乳糖苷酶菌株的篩選

馬宏偉1，王聰2，胡立新2，*

（1.內(nèi)蒙古蒙牛阿拉乳制品有限責(zé)任公司，北京 101107；2.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430068）

從內(nèi)蒙古寶格達(dá)山高山凍土以及乳制品中分離到25株嗜冷菌，利用產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶的模型篩選，獲得1株低溫酶高產(chǎn)菌株C。在以乳糖為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，該低溫酶的最適pH值為6.4，最適作用溫度為32℃，不同金屬離子對(duì)酶活影響：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+。4 ℃相對(duì)酶活為總酶活的 30%。

乳制品；嗜冷菌；低溫β-半乳糖苷酶；酶學(xué)性質(zhì)

新鮮乳制品的冷藏保鮮加工以及生產(chǎn)低乳糖牛奶與乳制品需要在低溫條件下具有高活性的β-半乳糖苷酶[1]，但目前低溫生產(chǎn)所用的常溫β-半乳糖苷酶的酶活力都很低而且成本較高[2]，難以滿足市場(chǎng)及生產(chǎn)所需。為解決相關(guān)問(wèn)題，應(yīng)首先著手于對(duì)低溫β-半乳糖苷酶菌株的分離篩選[3]。分離篩選出低溫分解乳糖高酶活菌株[4]，并對(duì)其低溫β-半乳糖苷酶性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

由內(nèi)蒙古寶格達(dá)山高山凍土中分離純化得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基：牛奶分解培養(yǎng)基（乳糖25 g，脫脂牛奶 10 g，瓊脂 2 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.0），淀粉分解培養(yǎng)基（乳糖25 g，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉 20 g，瓊脂 25 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0），Tween80分解培養(yǎng)基（乳糖25 g，蛋白胨20 g，NaCl 10 g，CaCl2·7H2O 0.2 g，Tween8020 mL，瓊脂 30 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0），纖維素分解培養(yǎng)基（乳糖25 g，蛋白胨 20 g，酵母粉 10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaC110 g，CMC—Na 15 g，瓊脂 25 g，蒸餾水 1000 mL，PH 7.0）。

1.1.3 儀器

數(shù)碼型生物顯微鏡XSP-13CD：上海豫光儀器有限公司；723PC分光光度計(jì)上海精密儀器儀表公司；恒溫水浴箱：WHC-15寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；V型溫度計(jì)：常州市新華儀表廠；PH-8414便攜式PH計(jì)：廣州市銘睿電子科技有限公司。

1.2 菌株的分離

將內(nèi)蒙古寶格達(dá)山凍土樣品取1 g放入500 mL的富集培養(yǎng)基中，于15℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)3 d。取富集菌懸液，稀釋涂布于選擇培養(yǎng)基上，15℃培養(yǎng)2 d，挑選單菌落，測(cè)定乳糖酶活性并進(jìn)行復(fù)篩。

1.3 產(chǎn)低溫酶菌株的篩選[5]

劃線培養(yǎng)牛奶分解培養(yǎng)基平板上，在5℃培養(yǎng)3d～5 d后觀察在平板上是否有半透明分解圈。劃線培養(yǎng)淀粉分解培養(yǎng)基平板上，在5℃培養(yǎng)6 d后觀察在平板上是否有無(wú)透明分解圈。將劃線培養(yǎng)Tween80分解培養(yǎng)基平板上，在5℃培養(yǎng)1周～2周后觀察菌體周圍有無(wú)模糊的暈圈。劃線培養(yǎng)纖維素分解培養(yǎng)基平板上，在5℃培養(yǎng)3周后，滴加1 mg/mL剛果紅染色1 h，再用1 mol/L的NaCl稀溶液沖洗平板，觀察能否在菌落周圍形成半透明的分解圈。

1.4 生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)[6]

分別將復(fù)篩得到菌株接種于20 mL培養(yǎng)基中，并于15℃，150 r/min一級(jí)培養(yǎng)。再將培養(yǎng)的菌懸液20 μL手工接至10 mL新鮮液體培養(yǎng)基中，分別在溫度5、10、15、20、25、30 ℃下振蕩培養(yǎng)，通過(guò) 3、6、9、12、15 h后測(cè)定菌懸液在420 nm處的吸光值。

1.5 β-半乳糖苷酶最適pH值的測(cè)定

配制pH值4～9的磷酸鈉緩沖溶液，于420 nm處測(cè)定不同pH值下的酶活。

1.6 不同金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶活的影響

在最適pH下，考察各種金屬離子，在吸光值420nm處測(cè)定酶活。

2 數(shù)據(jù)與分析

2.1 內(nèi)蒙古寶格達(dá)山凍土嗜冷菌的分離

在5℃下取內(nèi)蒙古寶格達(dá)山不同深度的多年凍土樣品，分析分離結(jié)果見表1，嗜冷菌數(shù)量在距地表180 cm深度的凍土樣品中的數(shù)量最多，并且土樣深度的增加，凍土樣品中分離出來(lái)的菌落多樣性增多。

表1 內(nèi)蒙古寶格達(dá)山凍土樣品中可培養(yǎng)嗜冷菌的數(shù)量Table1 Inner Mongolia bogd mountain permafrost samples can be cultured from the number of psychrophilic bacteria

2.2 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 內(nèi)蒙古寶格達(dá)山凍土嗜冷菌的生長(zhǎng)溫度特性

選取實(shí)驗(yàn)室保藏的1株中溫菌作為對(duì)照菌株，32℃時(shí)為最適生長(zhǎng)溫度。25株嗜冷菌在25℃～38℃左右是最適生長(zhǎng)溫度，在4℃時(shí)都可以生長(zhǎng)，而在33℃下大多數(shù)菌株不生長(zhǎng)，屬于典型的嗜冷菌。

2.2.2 β-半乳糖苷酶最適pH值測(cè)定

在不同的反應(yīng)pH值條件下測(cè)定的酶活結(jié)果見圖2。由圖可知，該酶的最適pH值為6.4。低溫β-半乳糖苷低溫酶偏酸性，這與目前報(bào)道的低溫β-半乳糖苷酶的最適pH偏堿性有一定差異。

2.2.3 不同金屬離子對(duì)低溫β-半乳糖苷酶活的影響用最適pH的不同金屬離子溶液稀釋酶液，在最適溫度條件下，測(cè)定酶活。試驗(yàn)結(jié)果表2所示。

表2 不同金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶活的影響Table2 Effects of metal ions on β-galactosidase activity

Mg2+、Mn2+、K+、Na+對(duì)低溫 β-半乳糖苷酶有激活作用，對(duì)該酶的影響為：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+，Mn2+激活作用最為明顯；Zn2+、Cu2+對(duì)低溫β-半乳糖苷酶有抑制作用，對(duì)該酶的影響為：Cu2+＞Zn2+。Na+、K+、Mn2+可提高酶活約40%～55%，而Zn2+、Cu2+抑制酶活15%左右。

2.3 內(nèi)蒙古寶格達(dá)山凍土嗜冷菌產(chǎn)低溫酶菌株的篩選

從25株嗜冷菌中篩選得到具有產(chǎn)2種低溫酶特性的菌株為 C1、C3、C8、C18、C23、C25，具有產(chǎn) 3 種低溫酶的特性的菌株為C2，結(jié)果如表3所示。C2不僅能夠產(chǎn)3種低溫酶并且具有較高活性。

表3 產(chǎn)低溫酶菌株的篩選Table3 Screening of strains producing low-temperature enzyme

3 結(jié)論

在以乳糖為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，該低溫酶的最適pH值為6.4，最適作用溫度為32℃，不同金屬離子對(duì)酶活影響：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+。在15℃、150 r/min及發(fā)酵48 h的條件下，該低溫酶產(chǎn)率及酶活最高。提高產(chǎn)酶性能[7]，改善分泌方式是今后的研究方向。

[1]秦燕.β-半乳糖苷酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(6):595-597

[2]陳衛(wèi),張灝,丁霄霖.一種高溫乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及對(duì)牛乳中乳糖的水解[J].中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(6):15-18

[3]韓中.一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶酵母菌株的選育研究[J].食品工業(yè)科技,2002(8):33-35

[4]鄭鐵曾,涂提坤,王建華,等.產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的分離和篩選[J].微生物學(xué)通報(bào)，1981，8(1)：258-260

[5]蔣燕靈,丁倩,邵靖宇.耐熱乳糖酶產(chǎn)生菌株的篩選及產(chǎn)酶條件試驗(yàn)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2001,3:110-114

[6]郭清泉,張?zhí)m威,林淑英.普通酸奶制品在貯存過(guò)程中發(fā)酵劑菌的β-半乳糖苷酶活性測(cè)定及變化規(guī)律研究[J].食品工業(yè)科技,2002,23(3):34-26

[7]陸淳,檀志芬,邱泉若,等.乳糖酶及其在乳品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè),2005,33(8):41-42

Low-temperature β-galactosidase Strain Screening

MA Hong-wei1，WANG Cong2，HU Li-xin2,*
（1.Inner Mongolia Mengniu Allah Dairy Co.,Ltd.,Beijing 101107，China;2.School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,Hubei,China）

From the Inner Mongolia bogd shan mountain permafrost,as well as dairy products were isolated 25 cold-resistant bacteria,the use of low-temperature β-galactosidase model of screening,access to one lowproducing strains of C.With lactose as the main carbon source in the fermentation medium,the optimum pH value of low-temperature enzyme was 6.4,the optimum reaction temperature was 32℃,different metal ions on the activity of enzyme impact:Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+.4 ℃ relative activity of the total activity of 30%.

dairy products；psychrophilic bacteria;low-temperature β-galactosidase;enzymatic properties

馬宏偉(1973—)，男（漢），碩士，研究方向：食品加工工藝。

*通訊作者：胡立新，1966，男，副教授。

2010-01-25