任永紅，張科，孫清嵐，王亞輝，莊遠紅，張亮

隨著人類基因組學(xué)研究的不斷進展，基因芯片正逐步成為檢測基因表達最強大的分子生物學(xué)技術(shù)方法。根據(jù)芯片上點制的探針不同，基因芯片主要可分為cDNA 芯片和寡核苷酸（Oligo）芯片 2 種類型。cDNA 芯片是將一些基因片段通過 PCR 方式制備探針，在早期應(yīng)用比較常見[1]。然而隨著越來越多的生物物種基因組測序的完成，Oligo 探針的設(shè)計成為可能，由于Oligo 芯片的特異性較cDNA 芯片好，并且制備起來不需要經(jīng)過繁瑣的PCR 擴增和純化回收過程，因此 Oligo 芯片已逐漸成為基因芯片中的應(yīng)用主流。目前制備 Oligo 芯片主要有 2 種方式[2]：第一種是在線方式（on line）的原位制作技術(shù)[3-4]，即在基片介質(zhì)上直接合成DNA 探針，例如美國 Affymetrix公司利用光刻掩膜方式在硅基片表面原位合成 25-mer 長度的Oligo 探針、美國 Agilent公司利用噴墨（ink-jet）方式在玻片表面合成 60-mer 長度的Oligo 探針、美國 LC Science公司利用酸堿法在硅基片表面非光刻掩膜合成 Oligo 探針等；第二種是離線方式（off line）的點制芯片技術(shù)[5-6]，即先利用 DNA 合成儀合成 Oligo 探針，然后用芯片點樣儀將 Oligo探針精確點制到基片表面上。第一類芯片制備方式需要復(fù)雜的設(shè)備、技術(shù)以及大量資金投入，只能由專門的實驗室制備；第二種芯片制備方法需要的硬件設(shè)備和操作技能都可以被一般的分子生物學(xué)實驗室所接受，并且點制芯片的制備方法是一個開放的平臺，研究者可以根據(jù)自己的研究目的制備多種類型的基因芯片，非常適合實驗室自行建立自己的基因芯片平臺。

目前國際上一些商業(yè)芯片公司在點制芯片的時候多用 60～70-mer 長度的探針，例如美國的Operon公司（擁有包括人、大鼠、小鼠等多個物種的全基因組Oligo 庫，其探針長度通常為70-mer）。從 Oligo 探針的合成效率和合成難度角度考慮，探針越長，單位價格越高?，F(xiàn)今國內(nèi)大多數(shù)公司就是以 60-mer 長度為界，探針合成價格相差 3 倍，但目前還沒有詳細的關(guān)于60-mer 長度以上和以下探針對實驗結(jié)果影響的研究報道。另外在檢測基因表達時，由于原核生物的mRNA 不含PolyA，難于針對 mRNA 進行特異性標(biāo)記，因此針對原核生物的基因表達檢測要遠比真核生物困難。鑒于此，我們選擇大腸桿菌基因表達信息作為實驗?zāi)Ｐ?，?59-mer和70-mer 長度 Oligo 探針的雜交信號進行分析比較，以探討探針長度對寡核苷酸基因芯片性價比優(yōu)勢的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 E.coli ATCC11775 菌株、晶芯 cRNA擴增標(biāo)記試劑盒（Cat#.360060）、DNA 點樣液、PersonalArrayer16TM芯片點樣儀、BioMixerTMII 芯片雜交儀、SlideWasherTM8 芯片清洗儀、LuxScanTM10K-A 激光共聚焦掃描儀、LuxScan 3.0數(shù)據(jù)分析軟件均為博奧生物有限公司產(chǎn)品，溶菌酶（lysozyme）（Cat#.RT401）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，NucleoSpin RNA II 試劑盒（Cat#.740.955.10）為德國 Machery Nagel（MN）公司產(chǎn)品，MessageAmp II-Bacteria 試劑盒（Cat#.1790）為美國 Ambion公司產(chǎn)品，ND-1000 型紫外分光光度計為美國 NanoDrop公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 從平板上挑取新的活化后E.coli ATCC11775 單菌落，接種于5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 12 h。取 50 μl 菌液轉(zhuǎn)入 5ml LB 中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 1～1.5 h 至對數(shù)生長期、吸光度（A600）值為0.5 左右。

1.2.2 菌株 RNA 提取 在1.5ml EP 管中加入1ml 菌液，14000×g 離心 2 min，吸棄上清。加入 100 μl 新鮮配制的1×TE 緩沖液（含有0.2 mg/ml 溶菌酶）重懸菌體，輕彈管壁混勻，37 ℃孵育 10 min。然后按照 NucleoSpin RNA II 試劑盒說明書提取 E.coli RNA。提取的RNA 樣品用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測，紫外分光光度計測量濃度，計算 RNA 總量，將 2個樣品等量混合用于后續(xù)芯片實驗。

1.2.3 探針設(shè)計與芯片點制 根據(jù)博奧生物有限公司已有大腸桿菌全基因組芯片數(shù)據(jù)選擇覆蓋高、中、低雜交信號強度的大腸桿菌基因共 20個。針對該 20個基因分別設(shè)計 59-mer和70-mer 長度的Oligo 探針（探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），探針序列見表1。將 Oligo 探針溶于點樣液中并調(diào)至終濃度為20 μmol/L，利用芯片點樣儀點制在經(jīng)過氨基修飾的基片上，每個探針重復(fù)2個點，點間距為250 μm，每個點陣共包含 10 行、10 列，探針分布示意圖見圖 1。點制于芯片上的樣品還包括用于監(jiān)控實驗過程的外標(biāo)探針 Y1-Y8、用于監(jiān)控核酸固定的Hex 探針 PC，以及陰性對照點樣液 NC。同時制備 4 張完全相同的芯片，點制好的芯片干燥后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 20個大腸桿菌基因的59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針序列Table1 The 59-mer and 70-mer oligo probes sequences of 20 E.coli genes

圖1 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針的芯片點陣分布Figure1 The probe layout of the 59-mer and 70-mer oligo probes on the array

1.2.4 芯片檢測

1.2.4.1 RNA 樣品標(biāo)記 首先采用 MessageAmp II-Bacteria 試劑盒對 RNA 進行 Ploy A 加尾，利用 T7 Oligo（dT）引物進行反轉(zhuǎn)錄合成一鏈 cDNA，DNA 聚合酶合成 cDNA 第二鏈，以雙鏈 DNA 為模板經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成 cRNA。參照文獻[7-11]改良方法，利用 cRNA 擴增標(biāo)記試劑盒對 cRNA進行反轉(zhuǎn)錄得到 DNA，最后在Klenow 酶的作用下利用隨機引物進行擴增，延伸過程中加入熒光素，具體標(biāo)記步驟見圖 2。

1.2.4.2 芯片預(yù)處理 將芯片點制有探針的一面在65 ℃ 水浴鍋上水合處理 2 次，每次 10 s。250 mJ 紫外強度下交聯(lián)，42 ℃ 預(yù)熱 0.5% SDS 清洗 10 min，42 ℃ 預(yù)熱蒸餾水清洗 2 min，離心甩干。

1.2.4.3 芯片雜交 將標(biāo)記后樣品加入含有 3×SSC、0.2% SDS、5×Dehart’t、25% 甲酰胺的雜交緩沖液中，42 ℃ 雜交 12～16 h，在芯片清洗儀中用 42 ℃ 預(yù)熱的洗液 I（2×SSC、0.2% SDS）和42 ℃ 預(yù)熱的洗液 II（0.2% SSC）分別清洗 4 min，離心甩干。重復(fù)雜交 4 張芯片。

圖2 大腸桿菌 RNA 樣品擴增標(biāo)記過程示意圖Figure2 Flow diagram for labeling E.coli RNA samples

1.2.4.4 芯片掃描 采用 LuxScanTM10K-A 激光共聚焦掃描儀掃描芯片獲取圖像，利用 LuxScan 3.0數(shù)據(jù)分析軟件將圖形文件轉(zhuǎn)換為數(shù)字文件，提取獲得 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用 Paired t test 進行顯著性分析，利用 Excel 計算各探針的雜交信號值（），以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探針設(shè)計

根據(jù)博奧生物有限公司已有大腸桿菌全基因組芯片數(shù)據(jù)選擇覆蓋高、中、低雜交信號強度的20個大腸桿菌基因分別設(shè)計 59-mer和70-mer長度 Oligo 探針，使得探針更具有生物學(xué)代表性；同時將 59-mer 長度探針設(shè)計位于70-mer 長度探針的內(nèi)部，以防止芯片雜交信號的差異與堿基組成有關(guān)。

2.2 大腸桿菌 RNA 質(zhì)檢

甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示大腸桿菌 28S rRNA和18S rRNA 條帶清晰，無降解帶出現(xiàn)，質(zhì)量合格（圖 3）。

圖3 大腸桿菌 RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測Figure3 Formaldehyde denatured agarose gel electrophoresis of E.coli total RNA

2.3 芯片檢測

我們將 59-mer和70-mer 長度探針點制在同一個芯片點陣中，一次雜交過程即可并行比較 2 種長度探針的雜交信號，以防止 2 種探針由于分布在不同芯片中所導(dǎo)致的雜交信號差異，共進行了4 張芯片的重復(fù)實驗。芯片雜交結(jié)果顯示同一個芯片中的59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號沒有差異（圖 4），陽性對照探針 Y1-Y8、PC 出現(xiàn)陽性雜交信號，陰性對照點樣液 NC 未檢測到雜交信號，符合質(zhì)控要求，因此判斷芯片雜交實驗成功。

2.4 雜交信號強度分析

圖4 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針芯片雜交圖Figure4 Hybridization figures of 59-mer and 70-mer oligo probes

為了直觀地比較 2 種探針的雜交信號，利用Excel 計算各探針的雜交信號值，并采用 Paired T test 進行顯著性分析，結(jié)果表明 59-mer和70-mer長度探針的雜交效率和雜交信號差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.9810）（圖 5）。

圖5 59-mer和70-mer 長度寡核苷酸探針的雜交信號強度Figure5 The hybridization signal intensities of 59-mer and 70-mer oligo probes

3 討論

以不同長度 Oligo 探針基因芯片進行基因表達檢測最主要的影響因素是探針的雜交信號，若雜交信號弱，會導(dǎo)致檢測信息丟失，出現(xiàn)假陰性。已有研究表明，短探針的雜交信號會較長探針弱，并且穩(wěn)定性差[12-13]，例如美國 Affymetrix公司制備的基因芯片探針長度只有 25-mer，得到的雜交信號較弱，為了彌補該缺陷，減少由于探針雜交信號弱導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，他們針對一個基因設(shè)計了多條探針，并且分為完全匹配和錯配的探針，利用多條探針的雜交信號值檢測豐度很低的基因。Affymetrix公司設(shè)計完全匹配和錯配的多條探針檢測基因表達的技術(shù)在一般實驗室難以進行，而其他的芯片公司，例如美國 Agilent和Roche NimbleGen公司都是利用 60-mer 以上長度的探針檢測包括原核和真核生物細胞的基因表達信息，這樣設(shè)計的芯片不用考慮設(shè)計完全匹配和錯配等多條探針，通過設(shè)計一條可靠的探針就能檢測到一個基因的表達信息，這種Oligo 探針基因芯片設(shè)計方法在一般實驗室都可以實現(xiàn)。但在國外已有的研究中都沒有考慮到探針合成的成本問題；而在國內(nèi)，60-mer 長度就是探針合成長度的一個分界線，價格差異很大，長度在60-mer 以上探針的合成費用是 60-mer 以下探針的3 倍以上，例如目前國內(nèi) 59-mer 長度探針的合成價格約為每個堿基 1.4 元，而 70-mer 長度探針的合成價格約為每個堿基 4.0 元。因此，結(jié)合探針長度對于雜交信號的影響以及探針的合成成本，我們對 59-mer和70-mer 長度探針對雜交信號強度的影響進行了分析比較。

在本實驗中，我們選擇了基因表達檢測難度較大的原核生物大腸桿菌的基因表達為模型，篩選出覆蓋高、中、低雜交信號強度的20個大腸桿菌基因，比較了 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號，結(jié)果表明 59-mer和70-mer 長度探針的雜交信號沒有顯著差異。而對于真核生物，已有研究表明 50～70-mer 長度的Oligo 探針均具有良好的特異性和靈敏度[14-17]，我們也成功應(yīng)用 59-mer 長度探針檢測了定制的60個大鼠基因的表達信息[18]，因此 59-mer 長度探針也可以用于檢測真核生物的基因表達信息。綜上，59-mer 長度探針合成費用不僅遠遠低于70-mer 長度探針，而且雜交信號強度也沒有明顯降低，可用于制備具有高性價比優(yōu)勢的寡核苷酸基因芯片，從而推動基因芯片技術(shù)更為廣泛的應(yīng)用。

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