汪愛媛，李永濱，許文靜，彭江，郭全義，趙斌，張莉，盧世璧

鎳鈦形狀記憶合金因具有形狀記憶效應、超彈性、較高的疲勞極限、優(yōu)良的耐磨性及良好的生物相容性而備受醫(yī)學界推崇。但伴隨應用的擴大，NiTi記憶合金鎳離子析出引發(fā)的安全性問題，成為亟需研究解決的難題。TiNb 合金為一惰性材料，以其突出的穩(wěn)定性、良好的生物相容性受到醫(yī)學界的重視。通過體外研究結果顯示：鈦鈮涂層修飾可防止或減少 NiTi 記憶合金中 Ni2+的析出，并保持一定的形狀記憶效應[1-3]。本論文研究 Ti 涂層及TiNb涂層的表面形貌及其對 Ni2+的屏蔽，體內(nèi)各器官Ni2+的聚集和肌肉組織生物相容性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 NiTi 記憶合金由北京百慕航材高科技股份有限公司提供；丙酮購自北京化工廠；超純水為美國 Millipore公司超純水系統(tǒng)產(chǎn)出，熱源濃度 0.001 eu/ml。

1.1.2 儀器 KQ-100VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；101-2 型電熱恒溫鼓風干燥箱為上海市實驗儀器總廠產(chǎn)品；XSAM800 型 X 射線光電子能譜為英國 Kratos公司的產(chǎn)品；JSM-35C 型掃描電鏡為日本電子公司的產(chǎn)品；XGT-2700 型 X 射線熒光分析顯微鏡為日本堀場公司產(chǎn)品；SOLAAR-M6 型石墨爐原子吸收光譜儀為美國熱電公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 選取成年雜種狗 18只，雌雄各半，體重（15±2）kg。由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為4組，NiTi 合金未涂層組、Ti 涂層組、TiNb 涂層組各 5只，空白組3只。觀察時間為12個月。

1.2 方法

1.2.1 植入體的制備 NiTi 記憶合金分為3組進行實驗，NiTi組：由其鑄件條材和柱材切割后經(jīng)過 SiC 砂紙逐級打磨拋光，去除表面雜質及污染物，制備成 10 mm×10 mm×10 mm 立方體，含Ni（原子比）48.4%，Ti 含量 51.6%；Ti 涂層組：以 NiTi 合金為基體，表面采用磁控濺射技術進行金屬鈦涂層；TiNb 涂層組：以 NiTi 合金為基體，表面采用同種技術進行鈦鈮合金涂層，涂層厚度同Ti 涂層組，工藝均在德國 KCH公司完成。

1.2.2 植入過程 氯氨酮等復合靜脈麻醉，術區(qū)備皮，消毒，取腰椎后正中切口，長約 10～12 cm，輕輕分離骶棘肌，實驗組動物埋入立方體試件，每側 5 枚，共 10 枚，相距 2.5～3.0 cm，深度 1.2 cm（圖 1）?？瞻讓φ战M術式相同，只是不植入任何物體即縫合。

圖1 立方植入體的植入Figure1 Implanted of the cubic implantations

術后肌注慶大霉素 8萬 U，1 次/日，共 3 d預防感染。分籠飼養(yǎng)，食用統(tǒng)一飼料。

1.2.3 取材和觀察指標 術后12個月處死動物取材，用陶瓷刀分別對每只犬的心、肝、脾、肺、腎、腦、骨、鼻咽黏膜、肌肉進行取材，去離子水沖洗后，獨立封裝，深低溫冷凍備用。送檢前置于冷凍干燥機內(nèi)（40×10-2Pa，–45 ℃）干燥 7 d，石墨爐原子吸收儀（GFAAS）檢測各組織或器官內(nèi)的Ni2+含量。

銳刀切取植入體周圍纖維囊和肌肉組織，10%甲醛溶液固定、脫水、常規(guī) HE 染色后進行組織學觀察。對植入體周圍纖維囊厚度進行顯微鏡下測量和結構分析。

1.2.4 評價標準 本實驗全部按照《醫(yī)療器械監(jiān)督管理和評價》（以下簡稱《評價》）有關醫(yī)療器械生物學評價標準進行設計、取材和評價[4]。組織反應分級：I 級，試樣周圍未見或僅見極少量淋巴細胞；II 級，試樣周圍可見少量淋巴細胞；III 級，試樣周圍有少量嗜中性粒細胞、淋巴細胞浸潤和巨細胞反應；IV 級，試樣周圍可見以嗜中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應，可見吞噬細胞。植入體周圍纖維囊（FCAI）：I 級，F(xiàn)CAI 厚度穩(wěn)定且≤ 0.03 mm，無繼續(xù)增生現(xiàn)象；II 級，F(xiàn)CAI 壁致密，壁的厚度比形成初期要??；III 級，植入體周圍可見纖維母細胞與膠原纖維，并已形成纖維囊腔結構；IV 級，植入體周圍可見小血管與纖維母細胞增生，開始形成疏松的囊壁。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS10.0 進行單因素方差分析和t 檢驗，以 P＜0.05 說明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 涂層后NiTi 合金表面成分的檢測

采用 XPS 方法通過結合能檢測其表面成分，刻蝕深度 0.1 μm，結果見表1。

未涂層 NiTi 合金樣品表面存在1.294%的鎳元素，而涂層組樣品表面均未測出鎳元素。同時TiNb 涂層組樣品表面檢測出2.992%的Nb 元素，而 Ti 涂層組樣品表面的Ti 元素含量增高。

2.2 涂層表面分析及厚度測量

采用斷口技術，用 SEM 觀察 NiTi 表面，可見明亮的光電反應層（圖 2A），經(jīng)過 Ti 或 TiNb涂層后，可見明顯界面（圖 2B），采用 X 射線熒光分析顯微鏡觀察，涂層更加清晰可見（圖 2C），黃色熒光帶為Ti 或 TiNb 涂層材料，黑色為背景色，涂層光滑，均勻，涂層厚度 3.25 μm。

2.3 鎳離子含量檢測

肝、腎、骨、肌肉等器官或組織中 Ni2+含量，結果見表2。

結果顯示，NiTi 無涂層組的肝、腎組織內(nèi)的鎳離子濃度分別為4.30和12.14 μg/kg，遠高于空白對照組和涂層組，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

表1 NiTi 及Ti、TiNb 涂層后表面成分含量（%）Table1 Content of surface component on NiTi alloy, Ti coated and TiNb coated alloys (%)

圖2 涂層表面分析Figure2 Surface analysis of coatings

表2 組織或器官中 Ni2+ 含量（干重均值，μg/kg）Table2 Concentrations of Ni2+ in tissues or organs (dry-weight, mean value, μg/kg)

圖3 骶棘肌內(nèi)植入標本 （A：NiTi 未涂層組；B：Ti 涂層組；C：TiNb 涂層組）Figure3 Implants embedded in sacrospinalis.A: NiTi group; B: Ti-coated group; C: TiNb-coated group.

2.4 組織相容性

三組植入體周圍均未見明顯滲出和水腫，纖維囊外肌肉色澤形態(tài)正常（圖 3），均具有良好的組織相容性，但 NiTi組植入體取材時植入體和纖維囊的結合較弱。

組織學圖片顯示三組植入體周圍均未見明顯巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，偶爾可見少量淋巴細胞（圖 4）。

將植入體周圍纖維囊剖開，取出植入體，銳刀切取部分非棱角處纖維囊及附帶的肌肉組織，固定后垂直于纖維囊和肌肉切片，顯微鏡下測量，每組各取 30 枚標本。NiTi組、Ti 涂層組、TiNb 涂層組纖維囊厚度分別為38.8、25.8和26.1 μm（表3）；NiTi 無涂層組纖維囊厚度最高，且與兩涂層組存在顯著差異（P＜0.01）；Ti 涂層組和TiNb 涂層組的纖維囊厚度沒有顯著差異（P ＞0.05）。

圖4 HE 染色組織學圖片（10×10）（A：NiTi組；B：Ti 涂層組；C：TiNb 涂層組）Figure4 HE-stained histological image (10×10).A, B and C represent NiTi group, Ti-coated group and TiNb-coated group.

表3 三組植入體周圍纖維囊厚度（μm， ）Table3 The thickness of fibrous capsule around implants in three groups (μm, )

表3 三組植入體周圍纖維囊厚度（μm， ）Table3 The thickness of fibrous capsule around implants in three groups (μm, )

注：a與NiTi組相比 P＜0.01；b與TiNb 涂層組相比 P ＞0.05Notes: a P＜0.01 vs.NiTi group; b P ＞0.05 vs.TiNb-coated group.

植入體Implants纖維囊厚度Thickness of fibrous capsule NiTi組 NiTi group 38.8±0.72 Ti 涂層組 Ti-coated group 25.8±0.53 a, b TiNb 涂層組 TiNb-coated group 26.1±0.66 a

3 討論

鎳鈦記憶合金是目前較為成熟的、唯一應用于醫(yī)學領域的記憶合金，具有獨特的超彈性和形狀記憶性能，具有巨大的開發(fā)和應用價值。然而，由于鎳的毒性已有大量文獻報道，可引起嚴重的局部組織刺激、壞死、過敏和潛在的致癌性，使得 NiTi 合金的臨床應用受到了一定限制。雖然 NiTi 記憶合金中的Ni是以化合態(tài)形式存在，其毒性遠比單質Ni 小，但防止鎳離子的析出，進一步提高 NiTi 合金的生物相容性和生物安全性不容忽視。

目前解決鎳離子析出的方法主要是記憶合金表面改性和修飾處理。主要有兩種途徑，一類是在記憶合金的表面附加一層保護屏障，阻止鎳離子的彌散，如 TiN、TiC和TiB2等；第二類是增加氧化層的厚度，對抗鎳離子的彌散。比較兩類表面處理方法的差異，尤其是作為骨科應用的植入物，第一類 TiN等涂覆保護層抗腐蝕，強度高，但長時間植入體內(nèi)仍然起化學反應，為TiN + O2→ TiO2+1/2N2。氧化反應發(fā)生后，材料表面的機械特性、電特性和電化學性也同時改變[5]。而第二類生成氧化層的方式研究較多，且對記憶合金的形狀記憶功能及超彈性影響較小，但存在氧化處理后外層鎳離子濃度升高及耐磨損差的缺點。因此，選擇一種惰性更高，強度更強，具有良好生物相容性的材料對NiTi 記憶合金表面進行涂層處理，可能是解決這一問題的關鍵。

在金屬材料中，通常認為鈦是無毒性的[6]。鈮國內(nèi)研究較晚，但國外已進行了大量的基礎和臨床研究，目前證明是具有良好生物相容性的金屬材料[7-9]，其與鈦的合金制品已進入臨床。

本研究中植入體涂層前 NiTi 表面含鈦3.396%，含鎳 1.294%。植入體內(nèi)后，未經(jīng)涂層處理的NiTi組肝、腎組織中 Ni2+含量分別是空白組的1.6和2.4 倍；這可能與試件在體內(nèi)的磨損有關。經(jīng) Ti 涂層后表面含鈦比例明顯增高，而表面Ni 元素消失；經(jīng) TiNb 涂層后，結果相似，并增加了 2.994%的Nb 元素。

經(jīng) Ti、TiNb 涂層后，試件周圍骨和肌肉組織及肝腎組織中均未檢測到高濃度的Ni2+存在，與未涂層的NiTi組其 Ni2+含量具有顯著差異，結果表明 Ti和TiNb 涂層可成功屏蔽 Ni 元素，減少或阻止了鎳離子的釋放。所以經(jīng)表面修飾后可有效提高 NiTi 合金的生物安全性。

當非生物活性植入體植入生物體時，會發(fā)生一系列反應，最后由膠原纖維包圍植入體形成纖維囊，對植入體周圍纖維囊結構和厚度的觀察便成為評價生物相容性的一項重要指標[10-11]。

影響植入體周圍纖維囊厚度因素很多，如活動狀況，植入位置，表面性質、形貌、外科植入過程、測量方法等[12-14]，大多數(shù)學者采用光學顯微鏡下測量，但制作過程容易產(chǎn)生誤差。有研究資料表明，棱角處纖維囊由于受植入體磨損較為嚴重，可能較其他處增厚，所以本實驗取材時預以避開。植入體背側由于有豐厚的纖維膜覆蓋，可能影響纖維囊的觀察，本試驗取材時也預以避開，而取深方肌肉及附近纖維囊。此外，組織的固定，系列脫水過程都可能與標本的滲透壓不同，使纖維囊厚度發(fā)生變化，影響實驗結果的準確性。所以本實驗認為，對不同組別植入體，在同一條件下對纖維囊厚度進行對比研究，對評價生物相容性更有價值。

本實驗結果按《評價》標準進行評價結果評價標準（合格）：植入 180 或 360 d 后兩種反應均≤ I 級，且每一期試樣組織學觀察，反應程度超過標準一級的片子數(shù)不得多于總數(shù)的1/4。從本實驗結果分析，大體觀察，植入體周圍未見明顯水腫，滲出，肌肉色澤、形態(tài)正常。組織學觀察，三組植入體均屬組織學 I 級，即三組植入體大體觀察和組織學觀察均具有良好的組織學相容性，和某些學者觀察結果一致[15-17]。FCAI結構以 TiNb組最佳，結構疏松，且于FCAI 內(nèi)可見大量毛細血管生成。FCAI 厚度，NiTi組＞30 μm，沒有達到 I 級標準，其余兩組均＜30 μm。FCAI 厚度統(tǒng)計學結果表明，NiTi組和Ti 涂層組、NiTi組和TiNb 涂層組FCAI 差異極顯著，Ti 涂層組和TiNb 涂層組差異不顯著。結果表明，NiTi組生物相容性欠佳，其余兩組生物相容性較好，但兩組間無顯著差異。

Ti 或 TiNb 涂層可有效防止 NiTi 記憶合金表面 Ni2+釋放，提高 NiTi 合金的生物相容性和安全性，為記憶合金在醫(yī)學領域的廣泛應用提供可能。

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