鹿亮，郭全義，楊啟友，袁玫，張莉，黃靖香，趙斌，彭江，許文靜，盧世璧

天然脫細(xì)胞基質(zhì)材料主要利用同種或異種器官（或組織），經(jīng)脫細(xì)胞、去除抗原處理后獲得。天然細(xì)胞外基質(zhì)（NECM）由細(xì)胞自身分泌，其圍繞在細(xì)胞周圍，主要含有膠原蛋白、纖維蛋白黏連素、層黏連蛋白以及層連素等。NECM 不僅為細(xì)胞提供支持結(jié)構(gòu)和附著位點(diǎn)，而且對細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化以及基因表達(dá)的調(diào)控都具有重要作用和顯著影響。目前已有動物研究報道應(yīng)用同種異體脫細(xì)胞材料成功修復(fù)了膀胱、尿道、動脈等組織[1-2]。但作為組織填充物，NECM 長期存在的生物安全性還有待進(jìn)一步探討。鑒于此，我們按照GB/T1688622003 標(biāo)準(zhǔn)[3]對豬來源關(guān)節(jié)軟骨 ECM制備的支架進(jìn)行生物安全性檢測，旨在為組織工程軟骨修復(fù)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

軟骨細(xì)胞來源于解放軍總醫(yī)院膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)切除的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本（獲得患者知情同意）。13個月齡的鮮豬四肢購自北京市屠宰場。健康新西蘭大白兔[體重 2.0～2.5 kg，合格證號：SCXK（京 2007-0003）]和雌性、健康小白鼠[6～8周齡、體重 20～25 g，合格證號：SCXK（京 2006-2009）]由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，均飼養(yǎng)于清潔普通環(huán)境中。胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)液、二甲基亞砜（dimethylsulfoxde，DMSO）、MTT 購自美國 Sigma公司，內(nèi)毒素檢測試劑盒（Cat#.295-51301）購自日本 Wako公司。MK3 型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國 Thermo公司，DU640 型紫外分光光度計購自美國 Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 支架的制備

1.2.1.1 脫細(xì)胞軟骨支架的制備 參照文獻(xiàn)[4]的方法，切取豬四肢關(guān)節(jié)軟骨，0～4 ℃ 浸泡于含苯甲基磺酰氟的PBS 中，超微濕法粉碎，充分稀釋后4 ℃、差速離心，收集上清。加入 1% TritonX-100，4 ℃ 持續(xù)振蕩 24 h 去除殘余細(xì)胞成分，加入含有5×104U/L 脫氧核糖核酸酶及1×103U/L 核糖核酸酶的混合液，37 ℃ 過夜，去除核物質(zhì)。4 ℃、10528×g 離心，收集沉淀，冷凍干燥制備成干凍干粉，加入稀鹽酸（pH3.2）配制成濃度為2%的溶液。將此溶液注入聚乙烯圓筒模具中，冷凍干燥后取出支架，距光源 5～10cm處用波長 258 nm紫外線照射交聯(lián) 2～8 h，再置于碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺無水乙醇溶液中 4 ℃ 交聯(lián)24 h。0.1 mol/L 磷酸氫二鈉清洗 2 h，無菌 PBS 中浸泡 2 h，三蒸水漂洗后凍干，60Co 消毒后密封，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 未脫細(xì)胞軟骨支架的制備 取不含軟骨膜及軟骨下骨成分的豬關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水洗凈瀝干后切成薄片，粉碎機(jī)粉碎。篩取 25～38 μm 大小的顆粒，三蒸水漂洗后10528×g 離心，收集沉淀注入聚乙烯圓筒模具中，冷凍干燥成支架后按“1.2.1.1”中方法進(jìn)行交聯(lián)和消毒處理后，4 ℃ 保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 體外細(xì)胞毒性實驗[3]采用酶消化方法[6]分離獲取人軟骨細(xì)胞，加入 20% DMEM 培養(yǎng)液制備成濃度為1×104個/ml的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種至 96 孔板（每孔 200 μl），培養(yǎng) 24 h，細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，進(jìn)行支架浸提液[無血清 DMEM培養(yǎng)液與脫細(xì)胞軟骨支架表面積按 1ml∶（3～6）cm2的比例混合，37 ℃ 靜置72 h]交換。實驗分 4組：分別加入濃度為100%、50%、25%的支架浸提液和20% DMEM 培養(yǎng)液（對照組），每組各設(shè) 3 孔。各組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 0、1、3、5、7、9 d 時，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后棄培養(yǎng)液，加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm 波長處測定吸光度（A）值，并按下列公式計算相對增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=（實驗組A 值/對照組A 值）×100%，根據(jù) RGR 值評定材料的毒性分級。評定標(biāo)準(zhǔn)：RGR ≥ 100% 為0 級；RGR 為75%～99%時為1 級；RGR 為50%～74% 時為2 級；RGR為25%～49% 時為3 級；RGR 為1%～24% 時為4 級；RGR 為0 時為5 級，其中 0 或 1 級為合格；2 級應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評價；3～5 級為不合格。

1.2.3 全身急性毒性實驗[3]取小白鼠 10只，隨機(jī)平均分成 2組：實驗組按 50ml/kg 劑量經(jīng)腹腔注射支架浸提液[0.9% NaCl 與脫細(xì)胞軟骨支架表面積按 1ml∶（3～6）cm2的比例混合，37 ℃ 靜置72 h]；對照組注射等量生理鹽水，注射后12、24、48、72 h 觀察小鼠的一般情況及不良反應(yīng)。

1.2.4 溶血實驗[3]取新采集的健康人外周血2ml（2% 草酸鉀抗凝），加入 0.9%的NaCl 2.5ml稀釋。實驗分 3組：支架浸提液[0.9% NaCl 與脫細(xì)胞軟骨支架表面積按 1ml∶（3～6）cm2的比例混合，37 ℃ 靜置72 h]（實驗組）、雙蒸水（陽性對照組）及生理鹽水組（陰性對照組），各 8ml/管，每組各設(shè) 3 管。37 ℃ 水浴溫箱保溫 60 min后，各組分別加入稀釋后外周血 0.2ml。用紫外分光光度計于545 nm 波長處測定 A 值，并按下列公式計算溶血程度。溶血程度=（實驗組A 值－陰性對照組A 值）/（陽性對照組A 值－陰性對照組A 值）×100%，以溶血程度＜5% 判定為無溶血作用。

1.2.5 熱原檢測實驗 將 1ml 支架浸提液[0.9%NaCl 與脫細(xì)胞軟骨支架表面積按 1ml∶（3～6）cm2的比例混合，37 ℃ 靜置72 h]加入內(nèi)毒素檢測試劑盒中，37 ℃ 靜置1 h 后觀察管中液體的混濁程度。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 皮內(nèi)刺激實驗[3]取新西蘭大白兔 3只，脊柱兩側(cè)背部備皮，暴露皮膚酒精消毒，兩側(cè)各選擇 5個點(diǎn)，2 點(diǎn)間隔 2 cm。一側(cè)各點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2ml 支架浸提液[0.9% NaCl 與脫細(xì)胞軟骨支架表面積按 1ml∶（3～6）cm2的比例混合，37 ℃ 靜置72 h]，另一側(cè)各點(diǎn)皮內(nèi)注射等量生理鹽水作為對照。于注射后立即和24、48、72 h 時分別觀察每個注射部位及周邊組織反應(yīng)（包括充血、腫脹、壞死等），并參照皮內(nèi)刺激記分標(biāo)準(zhǔn)（表1）評價結(jié)果。原發(fā)刺激指數(shù)（PⅡ）：無刺激為0～0.4 分；輕度刺激為0.5～1.9 分；中度刺激為2.0～4.9 分；強(qiáng)度刺激為5.0～8.0 分；總刺激評分 8 分。

表1 皮內(nèi)刺激記分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Intradermal stimulation score

1.2.7 體內(nèi)埋植實驗[3]取新西蘭大白兔 6只，常規(guī)背部備皮、消毒，取正中切口長約 7 cm，依次切開皮膚、皮下組織。將大白兔隨機(jī)平均分為2組：實驗組在兔背部深筋膜與肌膜之間埋植大小為0.8cm×0.5cm的豬脫細(xì)胞軟骨支架；對照組同法皮下埋植豬未脫細(xì)胞軟骨支架。每只大白兔背部均設(shè) 3個埋植點(diǎn)，各埋植點(diǎn)間距約 3 cm。皮膚切口均用 3-0 細(xì)絲線縫合，術(shù)后分組飼養(yǎng)。分別在埋植后1、2、4周時取支架以及周圍組織行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)檢測，觀察炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS10.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果的比較采用 t 檢驗，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨源性支架浸提液對細(xì)胞生長的影響

在連續(xù) 9 d的培養(yǎng)過程中，各組細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨源性支架浸提液中都生長良好，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。分別于培養(yǎng) 0、1、3、5、7、9 d 時測定 A490值，結(jié)果顯示與對照組相比，各時間點(diǎn)各組支架浸提液對細(xì)胞生長均無抑制作用，檢測結(jié)果均合格，表明制備的脫細(xì)胞軟骨支架無細(xì)胞毒性（圖 1）。

圖1 不同濃度支架浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線Figure1 The growth curve of different concentrations extracts of cultured cells

2.2 全身急性毒性實驗

注射后12、24、48、72 h 觀察小鼠的一般情況良好，活動、食欲正常，無呼吸困難，無腹部刺激癥狀及死亡現(xiàn)象。

2.3 溶血實驗

實驗組與陰性對照組均無明顯溶血現(xiàn)象，陽性對照組全部出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。實驗組溶血程度為1.3%，明顯低于溶血程度＜5%的判定標(biāo)準(zhǔn)（圖 2）。

圖2 豬脫細(xì)胞軟骨支架浸提液的溶血程度檢測Figure2 Hemolysis degree of acellular cartilage leaching fluid

2.4 熱原檢測與皮內(nèi)刺激實驗

支架浸提液熱原檢測呈陰性，表明無熱原存在。大白兔皮下注射浸提液后，連續(xù)觀察 3 d，各注射點(diǎn)及其周邊組織均未出現(xiàn)紅斑、水腫等刺激反應(yīng)，根據(jù)記分標(biāo)準(zhǔn)判定原發(fā)刺激指數(shù)為0 分，皮膚刺激實驗陰性。

2.5 體內(nèi)埋植實驗

2.5.1 大體觀察 埋植術(shù)后各組動物狀態(tài)良好，運(yùn)動和進(jìn)食正常，手術(shù)切口無紅腫、滲血和滲液等，切口一期愈合，無動物死亡。術(shù)后1、2周時，脫細(xì)胞軟骨支架和未脫細(xì)胞軟骨支架均與周圍組織無黏連，無包膜形成，周圍無血管侵入，很容易與周圍組織分離；術(shù)后4周時，脫細(xì)胞軟骨支架與未脫細(xì)胞軟骨支架均有小部分降解。

2.5.2 組織病理觀察 術(shù)后1周時，脫細(xì)胞軟骨支架中無明顯細(xì)胞浸潤（圖 3A）；未脫細(xì)胞軟骨支架中有少量原核細(xì)胞浸潤（圖 3D）。術(shù)后2周時，脫細(xì)胞軟骨支架中可見一定量的扁長細(xì)胞浸潤（圖3B），未見淋巴細(xì)胞浸潤，提示這些扁長細(xì)胞并非起到免疫排斥作用，可能為侵入材料的纖維細(xì)胞；未脫細(xì)胞軟骨支架中浸潤的原核細(xì)胞較術(shù)后1周時增多（圖 3E），并可見少量淋巴細(xì)胞浸潤。術(shù)后4周時，脫細(xì)胞軟骨支架有部分降解，且浸潤的細(xì)胞減少，仍未見淋巴細(xì)胞浸潤（圖 3C）；未脫細(xì)胞軟骨支架中浸潤的原核細(xì)胞仍很多，且在支架及其周圍組織中可見大量淋巴細(xì)胞浸潤（圖 3F）。

圖3 豬脫細(xì)胞軟骨支架與未脫細(xì)胞軟骨支架植入兔皮下后的組織病理觀察 HE×200（A、D：術(shù)后1周；B、E：術(shù)后2周；C、F：術(shù)后4周）Figure3 Porcine acellular cartilage scaffold, porcine non-acellular cartilage scaffold (HE, original magnification×200).A, D: One week after surgery; B, E: Two weeks after surgery; C, F: Four weeks after surgery.

3 討論

3.1 脫細(xì)胞軟骨支架的特征

制備組織工程軟骨支架材料的目的是為構(gòu)建軟骨細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu)，從而有利于細(xì)胞的黏附、增殖，并為細(xì)胞生長提供良好環(huán)境[7]，其中脫細(xì)胞軟骨支架構(gòu)建組織工程軟骨具有良好的應(yīng)用前景[4-5,8]。誘發(fā)免疫反應(yīng)的MHC 分子主要存在于有核細(xì)胞的細(xì)胞膜上，我們先后利用去污劑-酶四步法[5]以及新型的差速離心法[4]制備了天然的關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)作為支架材料，在去除細(xì)胞成分的同時又保持了關(guān)節(jié)軟骨的ECM 特征，最大限度地滿足了組織工程支架材料的要求。

3.2 脫細(xì)胞軟骨支架的生物相容性

任何新材料在應(yīng)用于臨床之前，都首先必須按照醫(yī)療器械生物學(xué)評價 ISO10993、GB/T16886 標(biāo)準(zhǔn)和要求進(jìn)行系列生物安全性評價，而體內(nèi)和體外實驗是目前評價材料生物安全性的主要手段[9-14]。

細(xì)胞毒性實驗是檢測材料擴(kuò)散或浸出成分毒性的一種簡便、快速、靈敏的方法，與材料的體內(nèi)毒性作用具有一定的相關(guān)性，因此本實驗選用快速精確的MTT 法，在短時間內(nèi)評價材料的細(xì)胞毒性具有一定的實際意義。另外，本實驗選擇不同濃度的浸提液，較為全面地評價了材料的毒性，結(jié)果顯示不同濃度組在0、1、3、5、7、9 d 時的A 值與對照組比較均無明顯差異。

溶血實驗通過測定材料與血細(xì)胞體外接觸后導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度，從而評價材料的體外溶血性能，是一項有意義的急性毒性篩選實驗。本研究材料的溶血程度為1.3%，符合 GB規(guī)定的溶血程度＜5%的要求，因此可認(rèn)為本材料無溶血作用，血液相容性好。

熱原檢測和皮內(nèi)刺激實驗也是評價生物安全性必不可少的實驗，本研究結(jié)果顯示豬脫細(xì)胞軟骨支架浸提液無熱原存在且原發(fā)刺激指數(shù)為0 分，這都符合生物材料的評價標(biāo)準(zhǔn)。

皮下埋植實驗結(jié)果顯示，脫細(xì)胞軟骨支架與未脫細(xì)胞軟骨支架相比具有很小的免疫原性，整個過程中脫細(xì)胞軟骨支架僅有輕微的炎癥反應(yīng)，且隨時間的增加而逐漸消退，無明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，表明支架埋入后無免疫排斥現(xiàn)象；而未脫細(xì)胞軟骨支架在術(shù)后4周時仍有大量的細(xì)胞浸潤，并有一定量的淋巴細(xì)胞浸潤。

綜上所述，豬脫細(xì)胞軟骨支架無毒、無刺激性，具有較好的生物安全性，是一種理想的軟骨組織工程支架材料。另外，我們還曾對豬來源的脫細(xì)胞軟骨支架進(jìn)行了理化性能以及材料降解方面的檢測，結(jié)果都符合關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的要求，具有良好的生物相容性。但作為支架材料，下一步我們將用其復(fù)合細(xì)胞對大動物關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)進(jìn)行深入研究。

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