眭翔，郭全義，袁玫，崔雪梅，盧世璧

腫瘤的免疫治療在經(jīng)歷大量實(shí)驗(yàn)研究后已開(kāi)始應(yīng)用于臨床，這也是提高腫瘤治療效果的一個(gè)新途徑，腫瘤的主動(dòng)特異性免疫治療（疫苗）和過(guò)繼免疫治療[如淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK 細(xì)胞）]均有一些臨床試用的初步結(jié)果[1-3]，但其治療效果尚不夠理想。目前，聯(lián)合應(yīng)用各種免疫方法將有望提高腫瘤免疫治療的效果，但免疫治療后機(jī)體免疫系統(tǒng)可能會(huì)產(chǎn)生免疫負(fù)調(diào)作用，如調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）的增加，所以如何克服這一負(fù)調(diào)作用也是現(xiàn)今免疫治療面臨并有待克服的問(wèn)題。因此，為了提高腫瘤的免疫治療效果，我們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用熱休克蛋白/肽（mixed heat shock protein/peptides，mHSP/P）疫苗和重組人 IL-2（rhIL-2）加用低劑量環(huán)磷酰胺（cyclophasphade，Cy）對(duì)小鼠肉瘤進(jìn)行聯(lián)合免疫治療，觀察這種聯(lián)合免疫對(duì)小鼠肉瘤療效的增強(qiáng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí) BALB/C 小鼠，雌性，6～8周齡，體重 18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[合格證號(hào)：SCXK（京）2000-0006]，按嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼養(yǎng)方法和條件飼養(yǎng)于我院 SPF 級(jí)動(dòng)物房。小鼠肉瘤 S180 細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王玉芝教授惠贈(zèng)，取小鼠腹水中瘤細(xì)胞，液氮冷凍保存。rhIL-2 購(gòu)自北京雙鹿藥業(yè)股份有限公司，Cy 購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，Sephacryl S-200HR凝膠層析柱購(gòu)自瑞典 Amersham Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞接種 S180 細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行解凍、復(fù)蘇，臺(tái)盼藍(lán)染色拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) ≥ 95%。用 DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整至 5×104/只，以 0.1ml 于小鼠背部皮下注射。

1.2.2 疫苗分離制備 從 S180 細(xì)胞肉瘤組織分離混合 mHSP/P 疫苗，具體步驟為：①取小鼠皮下S180 細(xì)胞肉瘤組織，剪碎研磨，加入 10 倍體積的細(xì)胞裂解液（30 mmol/L NaHCO3、0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟，pH 7.1），振搖破膜；②將上述獲得的細(xì)胞裂解液于4 ℃、75000×g 離心 2.5 h，棄沉淀，取上清透析；③上 Sephacryl S-200HR 凝膠層析柱，加入分子篩洗脫液，分步收集，在相對(duì)分子質(zhì)量（5～20）×104段截取收集洗脫液，即為混合mHSP/P 疫苗；④經(jīng) 12% SDS-PAGE 分析后進(jìn)行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡鑒定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與治療方案 于S180 細(xì)胞接種后第 2 天開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并分組。

⑴ mHSP/P + Cy + rhIL-2：20 μg/只于小鼠下肢腹股溝皮下注射 mHSP/P，每 7 d 免疫 1 次；第3 次 mHSP/P 免疫后次日 3 mg/只于小鼠腹腔注射 Cy 1 次；Cy 注射后第 3 天于小鼠皮下注射不同劑量的rhIL-2，分別為每次 1×104IU/只（I組、5只小鼠）、5×104IU/只（C組、10只小鼠）、1×105IU/只（D組、10只小鼠）、1×106IU/只（H組、5只小鼠），連續(xù) 5 次，每天 1 次，此即為第 1 療程結(jié)束。第 1 療程完成后7 d 開(kāi)始進(jìn)行第 2 療程，即 mHSP/P 免疫 1 次后進(jìn)行 Cy和rhIL-2治療，方案同前；第 2 療程完成后7 d 再開(kāi)始進(jìn)行第 3 療程，方案同第 2 療程。共 3個(gè)療程。

⑵ Cy + mHSP/P + rhIL-2：E組。3 mg/只于小鼠腹腔注射 Cy 1 次后1 d 進(jìn)行 mHSP/P 免疫，mHSP/P、rhIL-2 劑量均與C組治療方案相同，僅1個(gè)療程。10只小鼠。

⑶單用 mHSP/P：B組。20 μg/只于小鼠下肢腹股溝皮下注射 mHSP/P，每 7 d 免疫 1 次，共免疫 3 次。10只小鼠。

⑷ Cy + mHSP/P：F和G組。3 mg/只于小鼠腹腔注射 Cy 1 次后1 d 進(jìn)行 mHSP/P 免疫（20 μg/只、每 7 d 免疫 1 次、共免疫 3 次）。其中 F組為2個(gè)療程，G組為1個(gè)療程。每組各10只小鼠。

⑸對(duì)照組：A組。注射 0.1ml 生理鹽水。10只小鼠。

1.2.4 療效觀察指標(biāo) 自腫瘤移植后至第 45 天，每隔 3 d 觀察并記錄小鼠腫瘤的生長(zhǎng)變化，按下列公式：V=L×W×W/2（L 為腫瘤最長(zhǎng)徑，W 為與L 垂直的最寬徑）計(jì)算腫瘤體積。以腫瘤移植后3個(gè)月仍無(wú)瘤生長(zhǎng)或腫瘤逐漸縮小至消失為參照標(biāo)準(zhǔn)，觀察各組小鼠的無(wú)瘤生存情況，同時(shí)記錄死亡鼠的生存期（長(zhǎng)期存活鼠按生存 90 d 計(jì)算），進(jìn)行平均生存期比較。以對(duì)照組的腫瘤體積為參照，計(jì)算腫瘤移植后第 35 天各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制率，腫瘤生長(zhǎng)抑制率=[1－（實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積）]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。腫瘤體積的比較采用單因素方差分析，生存期的比較采用 Kaplan-Meier 單因素分析，以 P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 混合 mHSP/P 疫苗的鑒定

從 S180 細(xì)胞肉瘤組織獲得混合 mHSP/P 疫苗，每克瘤重得量為2.5 μg。12% SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約為110、96、70、60 處分別可見(jiàn)包含 HSP110、Gp96、HSP70、HSP60的混合 mHSP 疫苗的特異性條帶（圖 1）。

圖1 混合 mHSP/P 疫苗的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析Figure1 SDS-PAGE analysis and Western blotting of the mHSP/P

2.2 腫瘤生長(zhǎng)體積

與對(duì)照組（A組）比較，C組小鼠的腫瘤體積明顯縮小，抗腫瘤效應(yīng)明顯，其次為D和E組（均P＜0.01）；而其余各組小鼠的腫瘤體積與對(duì)照組（A組）相比均無(wú)明顯差異（圖 2）。

2.3 小鼠的無(wú)瘤生存與平均生存期比較

C組無(wú)瘤生存小鼠數(shù)量最多（3/10），其次為D組（2/10）和E、F組（各 1/10）；而其余各組均未見(jiàn)無(wú)瘤生存小鼠（表1，圖 3）。平均生存期比較結(jié)果顯示，B、C、D、E、I組分別與對(duì)照組（A組）相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）（表1）；其中 C組小鼠的生存期延長(zhǎng)效果最佳，平均延長(zhǎng)了 26 d。

2.4 腫瘤移植后第 35 天腫瘤生長(zhǎng)抑制率

圖2 免疫治療后各組荷瘤小鼠的腫瘤體積生長(zhǎng)曲線Figure2 Tumor growth curre of S180 tumor in mice after various treatments

表1 免疫治療后各組荷瘤小鼠的生存情況Table1 Effect of various vaccinations on the survival of S180 tumor-bearing mice

圖3 免疫治療后各組荷瘤小鼠的Kaplan-Meier 生存曲線Figure3 Effect of various vaccinations on the survival of S180 tumor-bearing mice

I組抑瘤效果最佳，而 G組最差。各組抑瘤率由高至低依次為I（88.3%）、F（82.1%）、D（76.0%）、C（65.1%）、E（60.4%）、H（57.5%）、B（49.2%）、G（23.1%）組。

3 討論

作為分子伴侶，mHSP 存在于細(xì)胞內(nèi)，具有與蛋白相結(jié)合和穩(wěn)定蛋白的作用，在腫瘤細(xì)胞中會(huì)表達(dá)增多，并可與多種腫瘤抗原肽相結(jié)合；從腫瘤細(xì)胞中分離提取 HSP/P，以之為疫苗注射入機(jī)體后，被抗原遞呈細(xì)胞攝取后與MHC結(jié)合，抗原遞呈細(xì)胞成熟后活化淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)；并且由于HSP能與多種抗原肽結(jié)合，因而是多價(jià)疫苗[4-6]。我們?cè)鴳?yīng)用混合 mHSP/P 為疫苗進(jìn)行預(yù)防性免疫治療，即在移植腫瘤細(xì)胞前先注射疫苗，取得了良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用[7]，但此疫苗應(yīng)用于腫瘤治療（即先移植腫瘤后進(jìn)行免疫治療）的效果不佳，因此我們考慮采用聯(lián)合免疫方法以增強(qiáng)其療效。IL-2 在臨床應(yīng)用時(shí)需加大劑量才會(huì)有效，而其毒副作用又限制了其應(yīng)用，以 IL-2 作為疫苗的輔助治療藥物，只用較小的劑量即可增強(qiáng)腫瘤的免疫治療作用，這已有相關(guān)報(bào)道，但多應(yīng)用于對(duì)免疫較為敏感的腫瘤，如黑色素瘤及腎癌等[8-9]，用于肉瘤治療的報(bào)道甚少。而小劑量 Cy 具有抑制 Treg 細(xì)胞的作用，可以降低免疫負(fù)調(diào)作用[10]，因此本研究采用混合 mHSP/P 疫苗加 rhIL-2和小劑量 Cy 聯(lián)合治療，以觀察其對(duì)小鼠肉瘤的免疫治療效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①3 種免疫制劑聯(lián)合應(yīng)用可使部分腫瘤消退（治愈），并明顯延長(zhǎng)生存期，較單用 mHSP/P 好；②適量的rhIL-2 與mHSP/P 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可以增強(qiáng)免疫治療作用，但大劑量反而不好（1×106IU/只），最適劑量應(yīng)為5×104～1×105IU/只；③多療程免疫較單療程（E組）效果好，不僅 mHSP/P 要多療程應(yīng)用，rhIL-2 及Cy 也要同時(shí)多療程應(yīng)用，因?yàn)閾?jù)報(bào)道一般在給藥 14 d 后Cy 才能發(fā)揮增強(qiáng) T 細(xì)胞的殺傷作用[11]；④Cy +mHSP/P 2個(gè)療程（F組）較單療程（G組）效果好，可能與Cy 降低了免疫負(fù)調(diào)作用有關(guān)，這也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12]。

為降低免疫抑制作用，特別是 Treg 細(xì)胞，我們加用小劑量的Cy，然而關(guān)于應(yīng)用 Cy的時(shí)機(jī)與劑量也有不同的報(bào)道[11-12]。我們分別選擇在疫苗前、疫苗后rhIL-2 前應(yīng)用 Cy，結(jié)果表明在疫苗前或疫苗后rhIL-2 前均可應(yīng)用。綜上所述，本研究的強(qiáng)化免疫方案為臨床肉瘤治療提供了較為詳細(xì)的參考基礎(chǔ)。

[1]Ueda Y, Sonoyama T, Itoi H, et al.Locoregional adoptive immunotherapy using LAK cells and IL-2 against liver metastases from digestive tract cancer.Gan To Kagaku Ryoho, 2000, 27(12):1962-19625.

[2]Parmiani G, Testori A, Maio M, et al.Heat shock proteins and their use as anticancer vaccines.Clin Cancer Res, 2004, 10(24):8142-8146.

[3]Aalamian M, Fuchs E, Gupta R, et al.Autologous renal cell cancer vaccines using heat shock protein-peptide complexes.Urol Oncol,2006, 24(5):425-433.

[4]Srivastava P.Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses.Ann Rev Immunol, 2002, 20:395-425.

[5]Ishii T, Udono H, Yamano T, et al.Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins hsp70, hsp90, and gp96.J Immunol, 1999, 162(3):1303-1309.

[6]Rivoltini L, Castelli C, Carrabba M, et al.Human tumor-derived heat shock protein 96 mediates in vitro activation and in vivo expansion of melanoma- and colon carcinoma-specific T cells.J Immunol, 2003,171(7):3467-3474.

[7]Cui XM, Tang Y, Yuan M, et al.Experimental study of mixed heat shock protein /peptide for treatment of sarcoma in mice.Chin J Exp Surg, 2006, 23(5):636.(in Chinese) 崔雪梅, 湯宇, 袁玫,等.混合熱休克蛋白/肽復(fù)合物疫苗疫防治小鼠肉瘤.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2006, 23(5):636.

[8]Berinstein NL.Enhancing cancer vaccines with immunomodulators.Vaccine, 2007, 25 Suppl 2:B72-B88.

[9]Kudo-Saito C, Garnett CT, Wansley EK, et al.Intratumoral delivery of vector mediated IL-2 in combination with vaccine results in enhanced T cell avidity and anti-tumor activity.Cancer Immunol Immunother,2007, 56(12):1897-1910.

[10]Mihalyo MA, Doody AD, McAleer JP, et al.In vivo cyclophosphamide and IL-2 treatment impedes self-antigen-induced effector CD4 cell tolerization: implications for adoptive immunotherapy.J Immunol,2004, 172(9):5338-5345.

[11]Salem ML, Kadima AN, El-Naggar SA, et al.Defining the ability of cyclophosphamide preconditioning to enhance the antigen-specific CD8+ T-cell response to peptide vaccination: creation of a beneficial host microenvironment involving type I IFNs and myeloid cells.J Immonother, 2007, 30(1):40-53.

[12]Di Paolo NC, Tuve S, Ni S, et al.Effect of adenovirus-mediated heat shock protein expression and oncolysis in combination with low-dose cyclophosphamide treatment on antitumor immune responses.Cancer Res, 2006, 66(2):960-969.