郭峰，錢寶華，花美仙

血液循環(huán)的血液固有免疫系統(tǒng)由血漿補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)、紅細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)、血小板固有免疫子系統(tǒng)和白細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)構(gòu)成[1]。若采用系統(tǒng)生物學(xué)的復(fù)雜理論和數(shù)學(xué)公式計(jì)算探討這些子系統(tǒng)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，則必須通過(guò)在體外建立系統(tǒng)模式進(jìn)行系統(tǒng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[2]。根據(jù)研究目的不同，設(shè)計(jì)不同的系統(tǒng)模式，我們已建立了相關(guān)體外系統(tǒng)模式[3-4]，并朝著計(jì)算免疫學(xué)方向發(fā)展，在卡介苗治療腫瘤的免疫以及中藥多糖等生物免疫調(diào)節(jié)劑作用機(jī)制研究等[5]多方面有所應(yīng)用，我們?cè)诩t細(xì)胞固有免疫活性研究的基礎(chǔ)上，逐步發(fā)展與形成系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)的新概念，發(fā)現(xiàn)所有血細(xì)胞都具有固有免疫活性，可在體外用免疫原激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)，體外系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)免疫模式的建立，為系統(tǒng)免疫學(xué)提供了嶄新的研究方法，為尋找炎癥免疫反應(yīng)中關(guān)鍵免疫分子帶來(lái)了新的希望。下面為有關(guān)系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

枸櫞酸抗凝新鮮血來(lái)自長(zhǎng)海醫(yī)院血站 10 例青壯年獻(xiàn)血人員；IL-6、IL-10、IL-12 免疫酶聯(lián)試劑盒購(gòu)于上海茂元公司；C4 抗血清購(gòu)于美國(guó) DADE Behring 公司；鼠抗人 CD35-單抗購(gòu)于丹麥 DAKO 公司；FITC 標(biāo)記羊抗鼠 IgG 購(gòu)自上海華美生物有限公司；FITC 標(biāo)記鼠抗人CD55-單抗和 PE 標(biāo)記鼠抗人 CD59-單抗購(gòu)于美國(guó) BD 公司。BD-Facscan 型流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD 公司產(chǎn)品；DADE Behring BNProspec 速率散射比濁法測(cè)定儀購(gòu)于美國(guó)DADE Behring 公司。

1.2 方法

1.2.1 全血細(xì)胞懸液制備 將 3 ml 新鮮枸櫞酸抗凝新鮮血 2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后取上層血漿至另一試管（含血小板的血漿）中。在原試管中用生理鹽水恢復(fù)血細(xì)胞沉淀為原體積 3 ml，混勻后為全血細(xì)胞懸液（含紅細(xì)胞和所有血細(xì)胞）。

1.2.2 白細(xì)胞懸液制備 采用冰水破壞法[4]，取 2 支 10 ml試管，取 0.2 ml 全血細(xì)胞懸液，加蒸餾水 4 ml 混勻，在冰水中輕輕吹打 1min，然后用高滲鹽水（含氯化鈉 1.8%）4 ml 混勻，再加生理鹽水至滿，2500 r/min，離心半徑 20cm，3min 離心，棄上清液即得 0.2 ml 白細(xì)胞懸液（其中白細(xì)胞數(shù)量與全血細(xì)胞懸液中白細(xì)胞數(shù)量相同）。

1.2.3 S180 癌細(xì)胞激活全血細(xì)胞與白細(xì)胞固有免疫反應(yīng) 每個(gè)待測(cè)新鮮標(biāo)本（靜脈采血后 2 h 之內(nèi)）都設(shè)立免疫原激活全血組（自然實(shí)驗(yàn)組）、生理鹽水全血對(duì)照組（自然對(duì)照組）、免疫原激活白細(xì)胞組（分離實(shí)驗(yàn)組）和生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組（分離對(duì)照組），血細(xì)胞免疫活性采用異種腫瘤細(xì)胞抗原，免疫原性極強(qiáng)的滅活小鼠的艾氏腹水癌細(xì)胞懸液（S180株，濃度 5×106個(gè)/ml）按表1 及下述方法快速激活血細(xì)胞的固有免疫活性。

具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 免疫原 S180 癌細(xì)胞激活全血細(xì)胞和白細(xì)胞成分配表

按表1 分配的 4 組，分別混勻后，置于 37℃水浴箱溫育 1 h，2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后，取上清液置于 1 ml 塑料離心管中，–20℃冰凍保存，集中同批按 IL-6、IL-10 免疫酶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書常規(guī)程序測(cè)定，免疫原對(duì) IL-6 或 IL-10 的激活率與紅細(xì)胞對(duì) IL-6 或IL-10 的吸附率按下述公式計(jì)算。

免疫原激活率 = 實(shí)驗(yàn)組 － 相應(yīng)對(duì)照組含量/相應(yīng)對(duì)照組含量

紅細(xì)胞吸附率 = 分離對(duì)照組（或?qū)嶒?yàn)組）－ 自然對(duì)照組（或?qū)嶒?yàn)組）/分離對(duì)照組（或?qū)嶒?yàn)組）

1.2.4 大腸桿菌激活全血細(xì)胞固有免疫反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)按表2 分配表設(shè)計(jì)，分為免疫原激活全血組（自然實(shí)驗(yàn)組）和生理鹽水全血對(duì)照組（自然對(duì)照組）。使用 BNProspec 速率散射比濁法測(cè)定儀常規(guī)測(cè)定反應(yīng)液中補(bǔ)體 C4 含量。沉淀血細(xì)胞分別采用抗紅細(xì)胞 CD35 單抗間接免疫熒光法[1]，抗紅細(xì)胞 CD59 單抗直接免疫熒光法[5]，抗淋巴細(xì)胞 CD25單抗直接免疫熒光法[5]，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定紅細(xì)胞CD35、CD59 以及淋巴細(xì)胞 CD25 分子表達(dá)量的變化。

表2 大腸桿菌免疫原激活全血細(xì)胞成分配表

按表2 分配的 2 組管混勻后置于 37℃水浴箱溫育1 h 后，2500 r/min，離心半徑 20cm，離心 5min 后，取上清液置于 5 ml 塑料離心管中，–20℃冰凍保存，集中同批按 IL-10、IL-12 免疫酶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書常規(guī)程序測(cè)定；沉淀為全血細(xì)胞可測(cè)定各種血細(xì)胞的免疫分子，采用 CD59熒光標(biāo)記單抗直接測(cè)定法[5]，常規(guī)操作，加 PE 標(biāo)記鼠抗人CD59 抗體暗箱作用 20min 后，磷酸緩沖液（pH 7.2）洗滌 2 次，流式細(xì)胞儀測(cè)定紅細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析不同組之間差異，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，求t值和P值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S180 癌細(xì)胞激活全血細(xì)胞與白細(xì)胞固有免疫反應(yīng)

研究表明 S180 異種腫瘤細(xì)胞可激活白細(xì)胞使其分泌IL-6 和 IL-10（表3、4）。

表3 紅細(xì)胞在 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞免疫活性中對(duì) IL-6 的調(diào)控作用（±s）

表3 紅細(xì)胞在 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞免疫活性中對(duì) IL-6 的調(diào)控作用（±s）

注：a與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 11.647，P＜0.01；b與生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組相比，t = 6.7567，P＜0.01；c與生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組相比，t = 3.997，P＜0.05；d與生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組相比，t = 4.3495，P＜0.01；e與生理鹽水全血對(duì)照組吸附率相比，t = 2.3798，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）IL-6（pg/ml）免疫原激活率紅細(xì)胞吸附率免疫原激活全血組 10 3.61±0.52a, b 0.21±0.14 0.35±0.08e生理鹽水全血對(duì)照組 10 3.00±0.53c免疫原激活白細(xì)胞組 10 5.56±0.75d 0.37±0.22 0.27±0.07生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組 10 4.13±0.72

表4 紅細(xì)胞在 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞免疫活性中對(duì) IL-10 的調(diào)控作用（±s）

表4 紅細(xì)胞在 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞免疫活性中對(duì) IL-10 的調(diào)控作用（±s）

注：a與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 5.3129，P＜0.01；b與免疫原激活白細(xì)胞組相比，t = 3.5631，P＜0.01；c與生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組相比，t = 4.358，P＜0.01；d與生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組相比，t = 5.481，P＜0.01；e與白細(xì)胞分離組激活率相比，t = 2.811，P＜0.05；f與生理鹽水全血對(duì)照組吸附率相比，t = 2.7439，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）IL-10（pg/ml）免疫原激活率紅細(xì)胞吸附率免疫原激活全血組 10 6.24±0.58a, b 0.29±0.11e –0.20±0.12f生理鹽水全血對(duì)照組 10 4.85±0.59c –0.36±0.14免疫原激活白細(xì)胞組 10 5.25±0.66d 0.47±0.17生理鹽水白細(xì)胞對(duì)照組 10 3.62±0.67

S180 異種腫瘤細(xì)胞激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)中補(bǔ)體C4 含量、紅細(xì)胞 CD35、CD59、淋巴細(xì)胞 CD25 表達(dá)量的變化規(guī)律見(jiàn)表5。

表5 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞固有免疫活性中紅細(xì)胞CD35、CD59、淋巴細(xì)胞 CD25 表達(dá)量比較（±s）

表5 S180 異種腫瘤細(xì)胞激活人血細(xì)胞固有免疫活性中紅細(xì)胞CD35、CD59、淋巴細(xì)胞 CD25 表達(dá)量比較（±s）

注：a與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 2.2360，P＜0.05；b與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 2.5979，P＜0.05；c與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t =2.424，P＜0.05；d與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 27.9498，P＜0.01

組別 例數(shù)（n） 補(bǔ)體 C4 紅細(xì)胞 CD35 平均熒光強(qiáng)度 紅細(xì)胞 CD59 平均熒光強(qiáng)度 淋巴細(xì)胞 CD25 平均熒光強(qiáng)度免疫原激活全血組 10 0.06±0.01a 28.65±8.08b 118.12±24.74c 37.29±3.00d生理鹽水全血對(duì)照組 10 0.05±0.01 40.21±11.52 88.35±29.93 5.28±1.78

2.2 大腸桿菌激活全血細(xì)胞固有免疫反應(yīng)

大腸桿菌進(jìn)入血液后可使紅細(xì)胞 CD59 分子的表達(dá)量明顯上升，使白細(xì)胞分泌抑炎細(xì)胞因子 IL-10和促炎細(xì)胞因子 IL-12 的量都明顯上升（表6，P＜0.05），且達(dá)到一個(gè)新高度的平衡點(diǎn)。

3 討論

3.1 紅細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)白細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子 IL-6，而正調(diào)控抑炎細(xì)胞因子 IL-10

含有紅細(xì)胞的免疫原激活全血組 S180 激活白細(xì)胞分泌 IL-6 和 IL-10 的免疫原激活率與免疫原激活白細(xì)胞組的免疫原激活率相比，前組都明顯低于后組，結(jié)果表明紅細(xì)胞的存在，有緩沖免疫原對(duì)白細(xì)胞激活的負(fù)調(diào)節(jié)作用。從紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的吸附率比較分析，發(fā)現(xiàn)在 S180 細(xì)胞激活全血組的 IL-6 吸附率明顯高于無(wú) S180 細(xì)胞激活的生理鹽水全血對(duì)照組的紅細(xì)胞對(duì) IL-6 的吸附率，說(shuō)明在致病原存在的情況下，在血液循環(huán)引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)中，紅細(xì)胞對(duì) IL-6 吸附調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，使血液中免疫原激活后的白細(xì)胞分泌 IL-6 含量明顯下降，可減輕血循環(huán)中的免疫炎癥反應(yīng)[6-7]。從紅細(xì)胞 IL-10 的吸附率分析，發(fā)現(xiàn)吸附率都為負(fù)值，說(shuō)明紅細(xì)胞的存在可增強(qiáng)白細(xì)胞分泌抑炎因子 IL-10，使白細(xì)胞的免疫反應(yīng)得到適度的控制，而在 S180 細(xì)胞激活的全血組，紅細(xì)胞對(duì) IL-10 的吸附率負(fù)值數(shù)明顯小于無(wú)S180 細(xì)胞的生理鹽水全血對(duì)照組，說(shuō)明在致病原引發(fā)的血液免疫炎癥反應(yīng)時(shí)，紅細(xì)胞增強(qiáng)白細(xì)胞分泌抑炎因子 IL-10的作用明顯下降，這有利于消滅致病原的免疫炎癥反應(yīng)，這還表明在沒(méi)有病原體進(jìn)入血液循環(huán)的狀態(tài)下，紅細(xì)胞正調(diào)控白細(xì)胞分泌 IL-10 的能力明顯增強(qiáng)，使血循環(huán)免疫反應(yīng)處在休止?fàn)顟B(tài)，有利于機(jī)體血液循環(huán)生理功能的平衡發(fā)揮。紅細(xì)胞對(duì)促炎因子 IL-6 和抑炎因子 IL-10 調(diào)節(jié)的有關(guān)具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

表6 大腸桿菌激活人血細(xì)胞固有免疫活性中紅細(xì)胞CD59 分子與白細(xì)胞分泌 IL-10、IL-12 的比較（±s）

表6 大腸桿菌激活人血細(xì)胞固有免疫活性中紅細(xì)胞CD59 分子與白細(xì)胞分泌 IL-10、IL-12 的比較（±s）

注：a與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 2.5066，P＜0.05；b與生理鹽水全血組相比，t = 3.883，P＜0.01；c與生理鹽水全血對(duì)照組相比，t = 2.634，P＜0.05

組別 例數(shù)（n）紅細(xì)胞 CD59平均熒光強(qiáng)度IL-10（pg/ml）IL-12（pg/ml）免疫原激活全血組 10 451.70±29.50a 8.05±1.27b 1.856±0.751c生理鹽水全血對(duì)照組 10 416.52±33.16 6.08±0.98 1.191±0.274

3.2 免疫原可激活系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)，而紅細(xì)胞起著傳遞信息的主干道作用

從表5的結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)免疫原（艾氏腹水癌 S180 等）可激活補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)、紅細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)和白細(xì)胞免疫子系統(tǒng)，這是系統(tǒng)血液快速固有免疫反應(yīng)，免疫原激活補(bǔ)體系統(tǒng)使補(bǔ)體 C4 含量明顯上升，而紅細(xì)胞 CD35 分子表達(dá)量明顯下降。CD35 分子表達(dá)量下降，很可能是補(bǔ)體C3b、C4b 分子調(diào)理的免疫原黏附到紅細(xì)胞 CD35（CR1）分子，抗 CD35 單抗對(duì)紅細(xì)胞 CD35 結(jié)合量減少所致，而紅細(xì)胞 CD59 分子表達(dá)量明顯上升，與免疫原（S180）激活相關(guān)。淋巴細(xì)胞 CD25 表達(dá)量升高也與免疫原激活 T 淋巴細(xì)胞和 NK 細(xì)胞 CD25 分子活性有關(guān)。CD25 是 IL-2受體 α 鏈，而紅細(xì)胞 CD59 分子是 T 淋巴細(xì)胞和 NK 細(xì)胞 CD2 的配體，結(jié)果表明，經(jīng)補(bǔ)體調(diào)理的抗原被紅細(xì)胞CD35 黏附處理后，使紅細(xì)胞 CD59 分子活化表達(dá)量增加，與淋巴細(xì)胞 CD2 結(jié)合量增加，可使淋巴細(xì)胞活化程度增強(qiáng)，表現(xiàn)在 CD25 分子表達(dá)量明顯增加[5]，調(diào)控 IL-2 等細(xì)胞因子的平衡能力明顯增強(qiáng)。本次研究結(jié)果與前面研究[5]，結(jié)果是吻合的。免疫原進(jìn)入血液循環(huán)后，首先激活補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)，而后 85%被補(bǔ)體調(diào)理過(guò)的免疫原黏附到紅細(xì)胞 CD35 分子[2]，并激活紅細(xì)胞 CD59 分子的活性和使其表達(dá)量增加，而紅細(xì)胞 CD59 與淋巴細(xì)胞 CD2 結(jié)合量增加，激活淋巴細(xì)胞免疫活性，使淋巴細(xì)胞 CD25 分子表達(dá)量增加，紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞分泌 IL-2、IL-6、IL-10 的調(diào)控能力明顯增加。紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)有緩沖與平衡作用，在系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)中具有重要的傳遞信息，調(diào)控與平衡白細(xì)胞免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要作用。我們認(rèn)為在系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)中存在一個(gè)傳遞免疫信息的紅細(xì)胞固有免疫反應(yīng)的主干道，這就是現(xiàn)代系統(tǒng)血液免疫學(xué)研究中的重要理論與假設(shè)[5]。說(shuō)明血行感染體外實(shí)驗(yàn)免疫研究中，也可利用我們構(gòu)建的免疫原快速激活全血細(xì)胞免疫活性的測(cè)定法，探討感染的重要固有免疫細(xì)胞和分子以及關(guān)鍵機(jī)制的研究?？梢哉J(rèn)為紅細(xì)胞補(bǔ)體受體和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)中具有重要的關(guān)鍵分子的作用[3,6]。用現(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)的新概念去研究抗感染固有免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新點(diǎn)成果展現(xiàn)。

3.3 紅細(xì)胞 CD35 和 CD59 分子是抗血行感染的重要固有免疫分子

IL-10 主要由 Th2 細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制 Th1 細(xì)胞釋放細(xì)胞因子（IFN-Y 和 IL-2 等），IL-12 主要由具有抗原提呈功能的細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等）產(chǎn)生，活化的單核細(xì)胞是血液中 IL-6 主要來(lái)源，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞，都能在不同條件下產(chǎn)生 IL-6[8]。因此本文介紹的研究結(jié)果也表明紅細(xì)胞在調(diào)控各種白細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中具有非常重要的作用，是血液中白細(xì)胞固有免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要固有免疫細(xì)胞，紅細(xì)胞 CD35 與 CD59 分子是白細(xì)胞抗感染免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控中的重要固有免疫分子，值得深入研究。

總之，系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)是嶄新的研究領(lǐng)域，也是現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)重要的研究方向之一[9-10]?，F(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)新概念的提出，打破了原有的僅僅研究各種白細(xì)胞免疫功能之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的系統(tǒng)免疫學(xué)研究的局限，采用系統(tǒng)生物學(xué)思路去研究各種白細(xì)胞免疫功能與其他血細(xì)胞免疫活性以及體液物質(zhì)（包括補(bǔ)體、酶、激素、酯類等）之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[11-12]。而系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)研究是現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)的重要研究窗口[7]，可尋找新的突破點(diǎn)。我們創(chuàng)建的免疫原快速激活全血細(xì)胞免疫活性的體外系統(tǒng)模式測(cè)定方法系列，可廣泛應(yīng)用在系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)研究領(lǐng)域中，逐步弄清血漿補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)、紅細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)、血小板固有免疫子系統(tǒng)與白細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)之間的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制[3]。我們提出的紅細(xì)胞固有免疫主干道理論與體外系統(tǒng)模式研究方法，為現(xiàn)代系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)研究提供了扎實(shí)的方法與理論基礎(chǔ)，具有實(shí)用價(jià)值[13-15]；為機(jī)體血循環(huán)中復(fù)雜的系統(tǒng)固有免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究，提供了扎實(shí)的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)模式與方法；為尋找血循環(huán)中固有免疫炎癥反應(yīng)中重要免疫細(xì)胞和分子以及關(guān)鍵機(jī)制提供了簡(jiǎn)便可行的研究思路和實(shí)驗(yàn)研究體系。今后應(yīng)完善系統(tǒng)固有血液免疫學(xué)研究的各種科學(xué)設(shè)計(jì)與公式，探討和設(shè)計(jì)各種合理的數(shù)學(xué)公式計(jì)算，進(jìn)一步為我國(guó)現(xiàn)代系統(tǒng)固有血液免疫學(xué)研究深入發(fā)展與推廣，做出更好的奉獻(xiàn)[1,16]。

志謝本院實(shí)驗(yàn)診斷科張樂(lè)之主任技師、張軍博士、張微微技師在免疫酶聯(lián)與流式細(xì)胞儀測(cè)定技術(shù)工作中給予幫助，在此深表謝意。

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