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        3種非接觸式點樣針性能對比

        2010-07-12 06:05:24賈文剛
        生命科學儀器 2010年4期
        關鍵詞:點樣不同點生物芯片

        賈文剛

        (上海交通大學生命科學學院,上海數(shù)康生物科技有限公司)

        引言

        隨著科學的發(fā)展進步,與生物相關的技術也在飛速發(fā)展,其中生物芯片技術就是20世紀90年代發(fā)展起來的,是影響深遠的科技進展之一。

        生物芯片技術是將生物學、化學、物理學、光學、微電子學和計算機科學高度結(jié)合形成的一項交叉技術。生物芯片技術可以可以用于基因水平的表達檢測、基因的診斷、藥物的篩選、測序和疾病的診斷等方面[1]。生物芯片是采用光導原位合成或者微量點樣等方法,將核酸片段、多肽分子、蛋白等生物樣品按照一定順序固定于基片(玻片、硅片、PDMS、硝酸纖維素膜等)上,形成要求的陣列,然后與待測的生物樣品和標記的已知生物樣品進行雜交反應,再通過特定的掃描儀如激光共聚焦或者電荷偶聯(lián)攝像機(CCD)對雜交后的信號進行檢測,然后借助相應的軟件對雜交后的數(shù)據(jù)進行快速高效的分析,從而了解待測樣品中的生物信息。

        生物芯片制作由于考慮到制作成本和技術難度等因素,在制作過程中大都采用微量點樣的方法制作生物芯片。微量點樣技術是整個微陣列制作儀中的關鍵技術,微量點樣技術是采用接觸式或者非接觸式將生物樣品固定于基質(zhì)表面,非接觸式點樣技術由微量液壓系統(tǒng)和精確控制的微量點樣針協(xié)同工作,將樣品從點樣針尖口直接噴到基質(zhì)表面,而不用直接接觸基質(zhì)表面。微陣列生物芯片制作儀上搭載的點樣技術采用的點樣針對生物芯片制作非常關鍵,本文將對微陣列生物芯片制作儀采用非接觸式點樣技術使用的3種不同類型的點樣針,在點樣針的原理、應用和3種針的差異方面做初步研究。

        1 材料

        CEA(癌胚抗原)-1Ab和CEA-2Ab(CanAg公司),AFP(甲胎蛋白)-1Ab和AFP-2Ab(CanAg公司);POD(過氧化物辣根酶)和BSA(小牛血清白蛋白)購自(Roche 公司);硝酸纖維素膜(WhatMan 公司);發(fā)光液#37075A/B(Thermo Fisher公司);Nano-Plotter-2000型微陣列生物芯片制作儀(德國GeSim公司);GT5000型微陣列制作儀(美國BioDot 公司);CCD檢測液(上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司)。

        2 方法

        2.1 同一塊芯片上采用不同點樣針點樣

        將CEA一抗?jié)舛扔昧姿猁}緩沖液稀釋到0.6mg/ml,裁1塊7×8cm的硝酸纖維素膜分別在微陣列芯片制作儀上用Pico tip、Nano tip和Biojet Plus點樣針點樣,除BiojetPlus針未點10.0nl外,其余都分別點10.0nl和20.0nl,每點點2個復點。

        點好的芯片在膜上固定2hr,然后封裝到相應的模具內(nèi)再用2.5%BSA溶液封閉1hr,將液體甩干,在恒溫恒濕箱內(nèi)20℃、RH 30%干燥過夜備用。

        在芯片上加配制好的抗原溶液跟膜上固定的抗體反應1hr,反應結(jié)束后用tris-鹽酸緩沖液沖洗并甩干,加標記了辣根酶的二抗進行反應1hr,再用洗液沖洗拍干,將配制好的發(fā)光液加到芯片每個格子內(nèi),然后放入CCD掃描儀內(nèi)掃描拍照,借助相應的軟件對掃描結(jié)果進行處理分析。

        2.2 同一點樣針點不同體積的樣品

        將AFP一抗?jié)舛扔昧姿猁}緩沖液稀釋到0.2mg/ml。3種針分別在各自的機器上點不同體積的樣品點。Pico tip 分別點5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl;Nano-tip 分別點5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl;Biojet tip分別點20.0nl、40.0nl、80.0nl、160.0nl,點好芯片采用2.1相同的方法封裝、封閉和干燥過程,反應方式也采用2.1同樣的方法進行。

        2.3 兩種點樣針采用不同濃度樣品和不同體積點樣

        AFP一抗用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml。2種針分別在各自機器上點不同體積的樣品點,Pico tip每點體積設定為5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl;Nano tip每點設定體積為5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl,每個點點4個復點。制備好的芯片采用2.1相同的方法封裝、封閉和干燥,反應方式采用與2.1同樣的方法進行。

        3 . 非接觸點樣原理

        3.1 注射泵式非接觸式點樣原理

        注射泵式噴點點樣技術是借助注射泵的原理,先將樣品從點樣頭吸進管道內(nèi)或者在整個系統(tǒng)液罐內(nèi)充滿液體樣品,噴點時靠注射泵推,同時微小電磁閥打開,將設定的點樣體積在瞬間從噴頭噴出,噴到芯片基質(zhì)上形成所需要的陣列。

        此種點樣技術采用的是陶瓷材料制作的點樣針,點樣針口徑在100-190.0微米(um),該點樣針直接插在微電磁閥下面的細小塑料管上,點樣時生物樣品直接從該點樣針尖口噴出。

        3.2 壓電式非接觸式點樣原理

        在壓電點樣針上有一塊壓電材料,該壓電材料與電流接通,在點樣過程中給壓電材料固定頻率的脈沖電壓則壓電材料變形,從而將腔體內(nèi)的樣品瞬間從針尖擠壓出去,形成微小的生物樣品點。

        壓電式點樣原理是將生物樣品通過點樣頭吸到管體內(nèi),此時注射泵側(cè)通路關閉,而系統(tǒng)液和點樣頭管子整個貫通,在點樣過程中注射泵不動,而是靠點樣頭處的壓電材料變形將微小的樣品點從噴頭噴出,噴到芯片基質(zhì)上形成一定陣列。

        圖2 壓電式點樣原理[3]

        3.3 三種點樣針結(jié)構(gòu)對比

        壓電式點樣針腔體背面有一小塊壓電材料,具體見圖,Nano tip和Pico tip的結(jié)構(gòu)和針的孔徑有所不同:Nano tip只有一個微小腔體,而Pico tip有2個腔體;Nano tip點樣針的孔徑為70-75微米,Pico tip孔徑為35-40微米。

        噴點點樣針Biojet tip同微小電磁閥連接,具體外觀見圖,Biojet tip為中空的錐形結(jié)構(gòu),點樣針的孔徑為100-110微米。

        4 數(shù)據(jù)及分析

        4.1 三種點樣針都采用相同的一抗點樣,點樣體積在10.0nl和20.0nl時,Pico tip點樣針點出的樣品發(fā)光強度要比Nano tip的發(fā)光強度(URL)要高,分別高出16.4%和24.0%,而在點20.0nl條件下,Pico tip和Nano tip點樣出的樣品發(fā)光強度(URL)比Biojet tip分別高出45.0%和16.0%。見圖表1

        表1 不同點樣針信號變化

        4.2 不同點樣針隨點樣體積的不同信號和CV的變化

        表2 信號隨點樣體積的變化[不同點樣針]

        表3 CV隨點樣體積的變化[不同點樣針]

        4.3 不同點樣針、不同點樣體積和不同點樣濃度在發(fā)光強度和CV上的變化情況

        同一種針在相同的點樣體積下樣品濃度越高,發(fā)光強度也會隨之升高,這種情況在Pico tip點樣針上體現(xiàn)特別明顯,但是當點樣體積在40.0nl和80.0nl時不同樣品濃度的發(fā)光強度差異開始縮小。

        同一種點樣針點樣體積越小,CV越大,隨著點樣體積的增加,CV會逐漸減小。另外發(fā)現(xiàn)點樣濃度太低可能會影響到CV,點樣濃度高對CV的影響相對較小。

        表4 點樣體積隨點樣濃度的變化[Pico Tip]

        表5 CV隨不同點樣濃度和不同點樣體積的變化[Pico Tip]

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        4.4 圖像外觀

        對點出的樣品點在顯微鏡下拍攝,生化反應后對圖片進行了整理,具體外觀見下圖:

        5 討論

        從不同點樣針點出的點子形態(tài)觀察,同樣體積的點樣量使用不同點樣針點出的點子直徑

        有差異,Bio jet tip點同樣體積的生物樣品點子直徑明顯比壓電的兩種點樣針點的點子直徑要大,Nnao tip點同樣體積的點子直徑比Pico tip點出的點子直徑要小。

        本文在硝酸纖維素膜上對3種點樣針進行了測試對比。兩種壓電式點樣針點同樣體積樣品,反應后的發(fā)光強度比Bio jet tip要高,根據(jù)點樣體積不同高出的程度會有變化;點同樣體積的樣品Pico tip點出的點子反應后發(fā)光強度比Nano tip要高,不同點樣體積高出的程度會有不同。從均一性考察發(fā)現(xiàn)同一種針點樣體積越大發(fā)光強度的CV越小,通過比較點同樣體積的樣品Bio jet tip的CV最大,Nano tip的CV最小,Pico tip的CV次之。通過對生物樣品點樣濃度、點樣體積和不同針的狀態(tài)進行測試,認為在太低的濃度點樣可能會影響信號和CV。本次是在硝酸纖維素膜進行側(cè)測試對比實驗,在其它基質(zhì)如醛基化玻片或瓊脂糖玻片或PDMS需要對3種點樣針重新進行測試對比。

        在實際使用中如何選擇正確的tip對制作蛋白芯片非常重要。如果做高密度的基因芯片或者需要點極其微小量的樣品時,需要選擇Nano tip或者Pico tip作為制作芯片的關鍵部件;如做高密度的蛋白芯片,可以選擇Nano tip;對于做非高通量的蛋白芯片或者免疫斑點的定性檢測芯片,可以選擇Bio jet tip。

        Biojet tip是由陶瓷材料制作,一般使用壽命較長,只要沒有斷裂基本都可以使用,但是對于壓電的Nano tip 和Pico tip由于點樣針的孔口徑在35-75um,因此在使用中要特別注意針的清洗,注意樣品中的微小雜質(zhì)甚至空氣的塵埃。

        綜上所述,生物芯片制作過程中,采用非接觸式點樣原理點樣,了解非接觸式點樣技術中用的關鍵部件點樣針很重要,點樣針選擇對制作相應的生物芯片產(chǎn)品非常重要。

        [1]馬立人,蔣中華.生物芯片[M].北京:化工出版社,2000

        [2]BIODOT INC.[EB/OL].HTTP://www.biodot.com

        [3]Gesim company [EB/OL].HTTP://www.gesim.de

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