賈文剛

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海數(shù)康生物科技有限公司）

引言

隨著科學(xué)的發(fā)展進(jìn)步,與生物相關(guān)的技術(shù)也在飛速發(fā)展，其中生物芯片技術(shù)就是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的，是影響深遠(yuǎn)的科技進(jìn)展之一。

生物芯片技術(shù)是將生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、光學(xué)、微電子學(xué)和計算機(jī)科學(xué)高度結(jié)合形成的一項交叉技術(shù)。生物芯片技術(shù)可以可以用于基因水平的表達(dá)檢測、基因的診斷、藥物的篩選、測序和疾病的診斷等方面[1]。生物芯片是采用光導(dǎo)原位合成或者微量點(diǎn)樣等方法，將核酸片段、多肽分子、蛋白等生物樣品按照一定順序固定于基片(玻片、硅片、PDMS、硝酸纖維素膜等)上，形成要求的陣列，然后與待測的生物樣品和標(biāo)記的已知生物樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)，再通過特定的掃描儀如激光共聚焦或者電荷偶聯(lián)攝像機(jī)(CCD)對雜交后的信號進(jìn)行檢測，然后借助相應(yīng)的軟件對雜交后的數(shù)據(jù)進(jìn)行快速高效的分析，從而了解待測樣品中的生物信息。

生物芯片制作由于考慮到制作成本和技術(shù)難度等因素，在制作過程中大都采用微量點(diǎn)樣的方法制作生物芯片。微量點(diǎn)樣技術(shù)是整個微陣列制作儀中的關(guān)鍵技術(shù)，微量點(diǎn)樣技術(shù)是采用接觸式或者非接觸式將生物樣品固定于基質(zhì)表面，非接觸式點(diǎn)樣技術(shù)由微量液壓系統(tǒng)和精確控制的微量點(diǎn)樣針協(xié)同工作，將樣品從點(diǎn)樣針尖口直接噴到基質(zhì)表面，而不用直接接觸基質(zhì)表面。微陣列生物芯片制作儀上搭載的點(diǎn)樣技術(shù)采用的點(diǎn)樣針對生物芯片制作非常關(guān)鍵，本文將對微陣列生物芯片制作儀采用非接觸式點(diǎn)樣技術(shù)使用的3種不同類型的點(diǎn)樣針，在點(diǎn)樣針的原理、應(yīng)用和3種針的差異方面做初步研究。

1 材料

CEA(癌胚抗原)-1Ab和CEA-2Ab(CanAg公司)，AFP(甲胎蛋白)-1Ab和AFP-2Ab(CanAg公司)；POD(過氧化物辣根酶)和BSA(小牛血清白蛋白)購自(Roche 公司)；硝酸纖維素膜(WhatMan 公司)；發(fā)光液#37075A/B(Thermo Fisher公司)；Nano-Plotter-2000型微陣列生物芯片制作儀(德國GeSim公司)；GT5000型微陣列制作儀(美國BioDot 公司)；CCD檢測液(上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司)。

2 方法

2.1 同一塊芯片上采用不同點(diǎn)樣針點(diǎn)樣

將CEA一抗?jié)舛扔昧姿猁}緩沖液稀釋到0.6mg/ml，裁1塊7×8cm的硝酸纖維素膜分別在微陣列芯片制作儀上用Pico tip、Nano tip和Biojet Plus點(diǎn)樣針點(diǎn)樣，除BiojetPlus針未點(diǎn)10.0nl外，其余都分別點(diǎn)10.0nl和20.0nl，每點(diǎn)點(diǎn)2個復(fù)點(diǎn)。

點(diǎn)好的芯片在膜上固定2hr，然后封裝到相應(yīng)的模具內(nèi)再用2.5%BSA溶液封閉1hr，將液體甩干，在恒溫恒濕箱內(nèi)20℃、RH 30%干燥過夜備用。

在芯片上加配制好的抗原溶液跟膜上固定的抗體反應(yīng)1hr，反應(yīng)結(jié)束后用tris-鹽酸緩沖液沖洗并甩干，加標(biāo)記了辣根酶的二抗進(jìn)行反應(yīng)1hr，再用洗液沖洗拍干，將配制好的發(fā)光液加到芯片每個格子內(nèi)，然后放入CCD掃描儀內(nèi)掃描拍照，借助相應(yīng)的軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行處理分析。

2.2 同一點(diǎn)樣針點(diǎn)不同體積的樣品

將AFP一抗?jié)舛扔昧姿猁}緩沖液稀釋到0.2mg/ml。3種針分別在各自的機(jī)器上點(diǎn)不同體積的樣品點(diǎn)。Pico tip 分別點(diǎn)5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Nano-tip 分別點(diǎn)5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Biojet tip分別點(diǎn)20.0nl、40.0nl、80.0nl、160.0nl,點(diǎn)好芯片采用2.1相同的方法封裝、封閉和干燥過程，反應(yīng)方式也采用2.1同樣的方法進(jìn)行。

2.3 兩種點(diǎn)樣針采用不同濃度樣品和不同體積點(diǎn)樣

AFP一抗用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml。2種針分別在各自機(jī)器上點(diǎn)不同體積的樣品點(diǎn)，Pico tip每點(diǎn)體積設(shè)定為5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Nano tip每點(diǎn)設(shè)定體積為5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl，每個點(diǎn)點(diǎn)4個復(fù)點(diǎn)。制備好的芯片采用2.1相同的方法封裝、封閉和干燥，反應(yīng)方式采用與2.1同樣的方法進(jìn)行。

3 . 非接觸點(diǎn)樣原理

3.1 注射泵式非接觸式點(diǎn)樣原理

注射泵式噴點(diǎn)點(diǎn)樣技術(shù)是借助注射泵的原理，先將樣品從點(diǎn)樣頭吸進(jìn)管道內(nèi)或者在整個系統(tǒng)液罐內(nèi)充滿液體樣品，噴點(diǎn)時靠注射泵推，同時微小電磁閥打開，將設(shè)定的點(diǎn)樣體積在瞬間從噴頭噴出，噴到芯片基質(zhì)上形成所需要的陣列。

此種點(diǎn)樣技術(shù)采用的是陶瓷材料制作的點(diǎn)樣針，點(diǎn)樣針口徑在100-190.0微米（um）,該點(diǎn)樣針直接插在微電磁閥下面的細(xì)小塑料管上，點(diǎn)樣時生物樣品直接從該點(diǎn)樣針尖口噴出。

3.2 壓電式非接觸式點(diǎn)樣原理

在壓電點(diǎn)樣針上有一塊壓電材料，該壓電材料與電流接通，在點(diǎn)樣過程中給壓電材料固定頻率的脈沖電壓則壓電材料變形，從而將腔體內(nèi)的樣品瞬間從針尖擠壓出去，形成微小的生物樣品點(diǎn)。

壓電式點(diǎn)樣原理是將生物樣品通過點(diǎn)樣頭吸到管體內(nèi)，此時注射泵側(cè)通路關(guān)閉，而系統(tǒng)液和點(diǎn)樣頭管子整個貫通，在點(diǎn)樣過程中注射泵不動，而是靠點(diǎn)樣頭處的壓電材料變形將微小的樣品點(diǎn)從噴頭噴出，噴到芯片基質(zhì)上形成一定陣列。

圖2 壓電式點(diǎn)樣原理[3]

3.3 三種點(diǎn)樣針結(jié)構(gòu)對比

壓電式點(diǎn)樣針腔體背面有一小塊壓電材料，具體見圖，Nano tip和Pico tip的結(jié)構(gòu)和針的孔徑有所不同：Nano tip只有一個微小腔體，而Pico tip有2個腔體；Nano tip點(diǎn)樣針的孔徑為70-75微米，Pico tip孔徑為35-40微米。

噴點(diǎn)點(diǎn)樣針Biojet tip同微小電磁閥連接，具體外觀見圖，Biojet tip為中空的錐形結(jié)構(gòu)，點(diǎn)樣針的孔徑為100-110微米。

4 數(shù)據(jù)及分析

4.1 三種點(diǎn)樣針都采用相同的一抗點(diǎn)樣，點(diǎn)樣體積在10.0nl和20.0nl時，Pico tip點(diǎn)樣針點(diǎn)出的樣品發(fā)光強(qiáng)度要比Nano tip的發(fā)光強(qiáng)度(URL)要高，分別高出16.4%和24.0%,而在點(diǎn)20.0nl條件下，Pico tip和Nano tip點(diǎn)樣出的樣品發(fā)光強(qiáng)度(URL)比Biojet tip分別高出45.0%和16.0%。見圖表1

表1 不同點(diǎn)樣針信號變化

4.2 不同點(diǎn)樣針隨點(diǎn)樣體積的不同信號和CV的變化

表2 信號隨點(diǎn)樣體積的變化[不同點(diǎn)樣針]

表3 CV隨點(diǎn)樣體積的變化[不同點(diǎn)樣針]

4.3 不同點(diǎn)樣針、不同點(diǎn)樣體積和不同點(diǎn)樣濃度在發(fā)光強(qiáng)度和CV上的變化情況

同一種針在相同的點(diǎn)樣體積下樣品濃度越高，發(fā)光強(qiáng)度也會隨之升高，這種情況在Pico tip點(diǎn)樣針上體現(xiàn)特別明顯，但是當(dāng)點(diǎn)樣體積在40.0nl和80.0nl時不同樣品濃度的發(fā)光強(qiáng)度差異開始縮小。

同一種點(diǎn)樣針點(diǎn)樣體積越小，CV越大，隨著點(diǎn)樣體積的增加，CV會逐漸減小。另外發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣濃度太低可能會影響到CV，點(diǎn)樣濃度高對CV的影響相對較小。

表4 點(diǎn)樣體積隨點(diǎn)樣濃度的變化[Pico Tip]

表5 CV隨不同點(diǎn)樣濃度和不同點(diǎn)樣體積的變化[Pico Tip]

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4.4 圖像外觀

對點(diǎn)出的樣品點(diǎn)在顯微鏡下拍攝，生化反應(yīng)后對圖片進(jìn)行了整理，具體外觀見下圖：

5 討論

從不同點(diǎn)樣針點(diǎn)出的點(diǎn)子形態(tài)觀察，同樣體積的點(diǎn)樣量使用不同點(diǎn)樣針點(diǎn)出的點(diǎn)子直徑

有差異，Bio jet tip點(diǎn)同樣體積的生物樣品點(diǎn)子直徑明顯比壓電的兩種點(diǎn)樣針點(diǎn)的點(diǎn)子直徑要大，Nnao tip點(diǎn)同樣體積的點(diǎn)子直徑比Pico tip點(diǎn)出的點(diǎn)子直徑要小。

本文在硝酸纖維素膜上對3種點(diǎn)樣針進(jìn)行了測試對比。兩種壓電式點(diǎn)樣針點(diǎn)同樣體積樣品，反應(yīng)后的發(fā)光強(qiáng)度比Bio jet tip要高，根據(jù)點(diǎn)樣體積不同高出的程度會有變化；點(diǎn)同樣體積的樣品Pico tip點(diǎn)出的點(diǎn)子反應(yīng)后發(fā)光強(qiáng)度比Nano tip要高，不同點(diǎn)樣體積高出的程度會有不同。從均一性考察發(fā)現(xiàn)同一種針點(diǎn)樣體積越大發(fā)光強(qiáng)度的CV越小，通過比較點(diǎn)同樣體積的樣品Bio jet tip的CV最大，Nano tip的CV最小，Pico tip的CV次之。通過對生物樣品點(diǎn)樣濃度、點(diǎn)樣體積和不同針的狀態(tài)進(jìn)行測試，認(rèn)為在太低的濃度點(diǎn)樣可能會影響信號和CV。本次是在硝酸纖維素膜進(jìn)行側(cè)測試對比實驗，在其它基質(zhì)如醛基化玻片或瓊脂糖玻片或PDMS需要對3種點(diǎn)樣針重新進(jìn)行測試對比。

在實際使用中如何選擇正確的tip對制作蛋白芯片非常重要。如果做高密度的基因芯片或者需要點(diǎn)極其微小量的樣品時，需要選擇Nano tip或者Pico tip作為制作芯片的關(guān)鍵部件；如做高密度的蛋白芯片，可以選擇Nano tip；對于做非高通量的蛋白芯片或者免疫斑點(diǎn)的定性檢測芯片，可以選擇Bio jet tip。

Biojet tip是由陶瓷材料制作，一般使用壽命較長，只要沒有斷裂基本都可以使用，但是對于壓電的Nano tip 和Pico tip由于點(diǎn)樣針的孔口徑在35-75um，因此在使用中要特別注意針的清洗，注意樣品中的微小雜質(zhì)甚至空氣的塵埃。

綜上所述，生物芯片制作過程中，采用非接觸式點(diǎn)樣原理點(diǎn)樣，了解非接觸式點(diǎn)樣技術(shù)中用的關(guān)鍵部件點(diǎn)樣針很重要，點(diǎn)樣針選擇對制作相應(yīng)的生物芯片產(chǎn)品非常重要。

[1]馬立人，蔣中華.生物芯片[M].北京：化工出版社，2000

[2]BIODOT INC.[EB/OL].HTTP://www.biodot.com

[3]Gesim company [EB/OL].HTTP://www.gesim.de