夏巖石夏延斌蔣立文

（1 湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，永州 425006; 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，長沙 410128）

0. 言

豆豉是中國傳統(tǒng)民間豆制品之一。大豆經(jīng)微生物作用后不僅保留了大豆中原有營養(yǎng)成分，而且除去了大豆中不利人體的溶血素和胰蛋白酶抑制劑等有害物質(zhì)，同時產(chǎn)生一定量大豆多肽、大豆異黃酮、核黃素和維生素B12等活性成分，經(jīng)酶解后的營養(yǎng)成分易于人體吸收，并且味道鮮美，深受人們的喜歡[1,2]。利用純毛霉接種制曲生產(chǎn)豆豉，因培養(yǎng)時間較短，成品中的氨基態(tài)氮的含量不高，貨架后期產(chǎn)品易出現(xiàn)老化品質(zhì)變硬問題，影響口感。本實(shí)驗(yàn)擬通過前發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高豆豉前發(fā)酵過程中蛋白酶的形成，有助后發(fā)酵過程大豆蛋白的充分分解，提高產(chǎn)品氨基態(tài)氮含量，降低產(chǎn)品硬度。

1.料與方法

1.1.料與儀器

1.1.1.輔材料

大豆、邵陽大曲酒、生姜、麩皮和土豆全部市售。

毛霉菌：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供。

1.1.2.要藥品與試劑

葡萄糖、干酪素、L-酪氨酸、鹽酸、磷酸、硼砂、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸銅、硫酸鉀、甲醛等均為分析純。

1.1.3.要試驗(yàn)儀器

722S型分光光度計、SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器、YXQ.SG46.280型高壓蒸汽消毒器、250B型恒溫生化培養(yǎng)箱、S-3C型pH精密計、LD4-2A式醫(yī)用離心機(jī)、SW-CJ-IB標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺。

1.2.驗(yàn)方法

1.2.1.種的制備

菌種的活化：將斜面菌種在無菌操作臺接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，放在25～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h，放在冰箱中保存?zhèn)溆肹3]。

生產(chǎn)菌種制備：在300m1三角瓶中加入15g麩皮，按麩皮與水的質(zhì)量比1：1.1，混合均勻，三角瓶口塞棉塞并包扎防潮紙，于0.1MPa滅菌40min，取出搖動，冷卻到28～30℃，在無菌條件下進(jìn)行接種，平置于25～28℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h后扣瓶1次再培養(yǎng)，等瓶內(nèi)麩皮長滿菌絲及灰色孢子后取出備用[2]。

1.2.2.發(fā)酵溫度對豆豉毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

大豆蒸熟冷卻至室溫，按3%的接種量接種優(yōu)質(zhì)毛霉麩曲，分別置于10℃，15℃，20℃，25℃，28℃，35℃條件培養(yǎng)48h后測定毛坯的蛋白酶活力，以確定適宜的前發(fā)酵溫度。

1.2.3.發(fā)酵時間對豆豉毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

大豆蒸熟冷卻至室溫，按3%的接種量接種優(yōu)質(zhì)毛霉麩曲，置于25℃條件下培養(yǎng)，24h后開始測定毛坯的蛋白酶活力，每隔6h測定一次，以確定適宜的前發(fā)酵時間。

1.2.4.H值對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

用pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8等不同溶液制成孢子懸浮液進(jìn)行接種，置25℃條件進(jìn)行培養(yǎng)，期間用相應(yīng)的pH溶液進(jìn)行噴灑，維持培養(yǎng)期間的相對濕度，48h后測毛坯的蛋白酶活力，確定前發(fā)酵條件的適宜pH值。

1.2.5.aCl濃度對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

用0M，0.2M，0.4M，0.6M，0.8M，1.0M等不同濃度的NaCl溶液制成孢子懸浮液進(jìn)行接種，置25℃條件進(jìn)行培養(yǎng)，期間用相應(yīng)的NaCl溶液進(jìn)行噴灑，維持持培養(yǎng)間的濕度，48h后測毛坯的蛋白酶活力，探討NaCl溶液對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.2.6.源酶處理對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

采用30℃水浸泡大豆至衡重，濾干置30℃條件下發(fā)芽6h激活內(nèi)源酶，然后在45℃利用大豆內(nèi)源酶分別酶解大豆2h，4h，6h。處理后，熟化大豆進(jìn)行接種，25℃，培養(yǎng)48h后測豆豉毛坯的蛋白酶活力。

1.2.7.豉前發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

表1.豉前發(fā)酵條件的試驗(yàn)因素和水平

大豆于25℃浸泡至增重1～1.2倍，選擇內(nèi)源酶作用溫度、內(nèi)源酶作用時間、前發(fā)酵時間和NaCl濃度為試驗(yàn)因素，設(shè)置三個水平，進(jìn)行L9(43)的正交試驗(yàn)，各因素水平列于表1。豆豉前發(fā)酵后添加適當(dāng)食鹽、生姜和白酒，37℃后發(fā)酵7d，最后測定產(chǎn)品的氨基態(tài)氮、還原糖的含量和產(chǎn)品的硬度。進(jìn)一步確定前發(fā)酵條件用對豆豉產(chǎn)品品質(zhì)的影響，對各因素指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，從而優(yōu)化豆豉的前發(fā)酵條件。

1.3.測項(xiàng)目及方法

1.3.1.白酶活力的測定

1.3.1.1.酶液的制備 取一定量的豆豉毛坯，加入250毫升0.3M食鹽溶液，經(jīng)高速組織搗碎攪勻后于25℃抽提1h，取清濾液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行蛋白酶活力的測定。

1.3.1.2.活力的測定方法 采用福林試劑法[4]測定中性蛋白酶。酶活力定義為，在40℃，一定pH條件下1分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為一個蛋白酶活力單位。

1.3.2.化指標(biāo)的測定

氨基態(tài)氮的測定：采用甲醛法[5]。

還原糖的測定：采用3,5—二硝基水楊酸法(DNS法)[5]。

豆豉硬度的測定：采用精度0.5g藥物天平改裝成簡易硬度測定儀，天平的一端放水杯，另一端放樣品，樣品上方固定一個直徑3mm的長釘，在測定時以一定的流速添加水于水杯中，樣品所受壓力逐漸增大，直到豆豉斷裂。以豆豉的斷裂力(N)來判斷豆豉的硬度，每一批樣取10個樣品測量,取平均值[6]。

2.果與分析

2.1.發(fā)酵溫度對豆豉毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.2，前發(fā)酵不同溫度條件下豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖1。

圖1.發(fā)酵溫度對毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

圖2.發(fā)酵對毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

從圖1可知隨著培養(yǎng)溫度的升高，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在28℃條件下蛋白酶活達(dá)到最大，但溫度達(dá)35℃時，毛坯的蛋白酶活急劇下降。相關(guān)研究表明毛霉生長的溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高，菌體生長加快，但溫度達(dá)35℃時，毛霉菌生長受到抑制。菌體生長的優(yōu)劣直接影響產(chǎn)酶量，豆豉前發(fā)酵的溫度選擇25～28℃有利于毛坯中蛋白酶的積累。由于豆豉前發(fā)酵是一個開放的過程，28℃培養(yǎng)易感染雜菌，影響成品的品質(zhì)，因此選擇25℃進(jìn)行前發(fā)酵比較適合。

2.2.發(fā)酵時間對豆豉毛坯產(chǎn)蛋白酶的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.3，前發(fā)酵不同時間豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖2。由圖2可知，25℃條件下，隨培養(yǎng)時間的延長，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在48h，蛋白酶活達(dá)到最大。40～50h范圍內(nèi)，毛坯的蛋白酶活力比較穩(wěn)定，都有利于后發(fā)酵游離氨基酸的形成。隨著時間的延長，蛋白酶活有明顯的下降，可能是由于毛霉老化的原因。因此，豆豉前發(fā)酵制曲時間應(yīng)控制在40～50h，才有利于蛋白酶的積累和后發(fā)酵蛋白質(zhì)的分解。

2.3.H值對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.4，前發(fā)酵不同pH值條件豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖3。由圖3可知，在pH5～6的范圍內(nèi)，有利于豆豉毛坯積累蛋白酶，pH值過高或過低都會影響蛋白酶的產(chǎn)生。

圖3.H值對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

圖4.aCl濃度對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

2.4.aCl對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.5，前發(fā)酵不同NaCl濃度條件豆豉毛坯的蛋白酶活力為圖4。從圖4可知隨著NaCl溶液濃度的增加，豆豉毛坯的蛋白酶活力也相應(yīng)的提高。當(dāng)濃度達(dá)到0.6M時，蛋白酶活力最大，隨著NaCl溶液濃度的進(jìn)一步增加，蛋白酶活力急劇下降。可能的原因是NaCl能在水中產(chǎn)生電離而成為激活劑，促進(jìn)了毛霉菌株蛋白酶的合成代謝，并且可以使結(jié)合態(tài)的蛋白酶從菌絲體上游離出來，但NaCl濃度過高時，毛霉生長受到明顯的抑制，從而引起酶活的下降。

2.5.芽處理對前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.6， 不同發(fā)芽處理后，豆豉前發(fā)酵毛坯蛋白酶活力結(jié)果見表2。

表2.源酶處理對豆豉前發(fā)酵的影響

由表2可知，內(nèi)源酶處理能提高豆豉毛坯的蛋白酶活力,45℃處理6h毛坯的蛋白酶活力達(dá)到最大值。黃豆發(fā)芽過程中，由于分解酶和合成酶的作用，同時進(jìn)行分解和和合成的代謝，當(dāng)分解代謝占優(yōu)勢時，能提高熟化大豆內(nèi)的游離氨基酸、可溶性總糖及活性微量元素的含量，這有利于毛霉的生長和產(chǎn)蛋白酶；而當(dāng)合成代謝占優(yōu)勢時，游離活性成分的減少，毛霉的生長和產(chǎn)酶可能受到影響。鑒于生產(chǎn)周期和成本的考慮，45℃處理2h是最佳選擇。

2.6.豉前發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

選擇前發(fā)酵時間（A）、NaCl濃度（B）、內(nèi)源酶作用溫度（C）和內(nèi)源酶作用時間（D）為試驗(yàn)因素，設(shè)置三個水平，采用L9（43）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果列于表4。從表4的試驗(yàn)結(jié)果可看出，豆豉前發(fā)酵不同條件對豆豉后發(fā)酵產(chǎn)品的氨基態(tài)含量、還原糖的含量及產(chǎn)品的硬度都有明顯的影響，其中內(nèi)源酶作用溫度對豆豉產(chǎn)品三個指標(biāo)的極差值影響最大的，而其它因素的影響對不同的指標(biāo)有差異，其原因可能是適宜的內(nèi)源作用溫度最利于大豆物質(zhì)的分解，形成小分子物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)了豆豉后發(fā)酵過程中毛霉酶系對物質(zhì)的分解，從而增加了產(chǎn)品氨基態(tài)氮的含量，降低了產(chǎn)品的硬度。影響產(chǎn)品各指標(biāo)的因素主次順序見表5所示。

表4.發(fā)酵正交試驗(yàn)L9（43）的結(jié)果

K10.4450.4460.4190.433 K20.4420.4400.4420.446 K30.4460.4470.4720.454Σ=4還原糖的含量（%）R0.0040.0070.0530.021優(yōu)水平A3B3C3D3 K11.111.010.841.03 K20.971.001.070.97 K30.880.931.030.94Σ=8.85產(chǎn)品的硬度（N）R0.230.080.230.09優(yōu)水平A3B3C1D3表5 各指標(biāo)的極差分析試驗(yàn)指標(biāo)主次順序氨基態(tài)氮的含量（%）CABD還原糖的含量（%）CDBA產(chǎn)品的硬度（N）CABD

以產(chǎn)品的氨基態(tài)氮的含量和產(chǎn)品的硬度為指標(biāo)分析時，各因素的影響是一致的，且產(chǎn)品的鮮味和質(zhì)地對風(fēng)味的影響大，而產(chǎn)品還原糖的含量僅對風(fēng)味有一定的調(diào)和作用，不是主要影響因素，故選擇豆豉前發(fā)酵最佳條件為：A3B3C1D3，即前發(fā)酵時間55h ，NaCl濃度0.6M，內(nèi)源酶作用溫度為40℃，時間為2.5 h。

3. 論

綜上所述，影響豆豉前發(fā)酵的因素有多個，較為適宜的前發(fā)酵條件為溫度25℃，pH5～6之間，NaCl濃度0.6M，前發(fā)酵時間在55h，大豆經(jīng)過發(fā)芽內(nèi)源酶處理也有利于豆豉毛坯的蛋白酶積累和氨基態(tài)氮的提高，適宜的作用條件為浸泡大豆30℃發(fā)芽處理6h，40℃酶解2.5h。提高豆豉前發(fā)酵蛋白酶的活力，有利于豆豉后發(fā)酵期蛋白質(zhì)的分解，改善了成品的品質(zhì)和風(fēng)味。

[1]鄔玉香,夏延斌,劉愛玲.大豆異黃酮在豆豉生產(chǎn)中的穩(wěn)定性[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002（3）:237-238.

[2]蔣立文,周傳云,鄔玉香.傳統(tǒng)美食豆豉工業(yè)化生產(chǎn)的研究[J].食品科學(xué),2003(3):59-64.

[3]錢存柔,黃儀秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,2000.

[4]姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2001.

[5]王瑞芝,杜曉湘.中國腐乳釀造[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998.

[6]李遠(yuǎn)志,鄭素霞, 羅樹燦等.真空微波加工馬鈴薯脆片的工藝特性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(8):40-43.