邵金華劉凱楊錦兀

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖屬植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，是以右旋葡萄糖為基本單位，屬于多糖類(lèi)中的同多糖類(lèi)，具有線型的空間結(jié)構(gòu),存在于禾谷類(lèi)（包括大麥、燕麥、黑麥和小麥等）的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中。谷物類(lèi)β-葡聚糖獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，賦予了其獨(dú)特的性質(zhì)，能以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的粘度很高，給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了諸多的不便。β－葡聚糖酶屬于水解酶類(lèi)，具有降解β-葡聚糖，破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)；提高內(nèi)源性消化酶活性，減少腸道微生物，降低小腸內(nèi)容物粘度；利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,同時(shí)，提高生長(zhǎng)性能和糧食的轉(zhuǎn)化率，在食品、飼料工業(yè)等方面有廣闊應(yīng)用前景。

1.料和方法

1.1.種

突變株Bacillus subtilis spp.，由本實(shí)驗(yàn)室在校園內(nèi)的土壤中篩選后誘變制得。

1.2.要原料和試劑

大麥粉，購(gòu)自重慶漓泉啤酒廠，磨成粉，過(guò)80目篩。

標(biāo)準(zhǔn)大麥β－葡聚糖，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

其它試劑均為分析純。

1.3.養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1.本培養(yǎng)基(g/l00ml):

蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，瓊脂 1.8，NaCl0.4，pH 7.2; 121℃，25min滅菌。

1.3.2.始培養(yǎng)基（g/100mL）

大麥β-葡聚糖 0.2, KNO30.1, NaH2PO40.002, MgS040.03, CaCO30.005, FeCl30.002 , 剛果紅0.004,瓊脂1.8,pH 7.2，121℃，25 min滅菌。

1.3.3.瓶發(fā)酵條件

在250ml的三角瓶中裝入35ml培養(yǎng)基，1210C,滅菌 25 min，冷卻至室溫，接種（接種量為2.2x106個(gè)孢子/ml 發(fā)酵液），pH值6.5，370C, 200r/min振蕩培養(yǎng)60h。

1.4.驗(yàn)方法

1.4.1.－葡聚糖酶酶活力測(cè)定[1]待測(cè)粗酶液用pH6.0的乙酸鈉緩沖液稀釋一倍，取經(jīng)60℃預(yù)熱的此稀釋酶液1.0ml，加入經(jīng)60℃預(yù)熱的1.0%β-葡聚糖溶液1.0ml，60℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即加入DNS試劑3ml，混勻，立即用DNS法測(cè)定還原糖含量。酶活單位定義： 在上述反應(yīng)條件下1s中從大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1nmol葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（u）。

1.4.2.酵液，還原糖含量測(cè)定:DNS法[2]

1.4.3.酵液總糖含量測(cè)定:鹽酸水解法[3]

1.4.4.酵液pH測(cè)定:pH計(jì)法

1.4.5.酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上依次改變碳源和氮源的種類(lèi)及濃度，再分別確定各微量元素的最佳添加量。

2.果和討論

2.1.同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

用六種常見(jiàn)碳源分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，碳源添加量以總糖含量相等為依據(jù)。表2-1表明，大麥粉是最佳的碳源，可能是因?yàn)棣?葡聚糖酶是一種典型誘導(dǎo)酶，特定的碳源對(duì)酶合成具有一定誘導(dǎo)效應(yīng)[4]。

表2.1碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

本實(shí)驗(yàn)選擇了常用的幾種無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源進(jìn)行氮源單因素實(shí)驗(yàn)(添加量以N元素摩爾數(shù)相等為依據(jù))。結(jié)果表明，酵母粉為最好的氮源，其次為豆餅粉。

表2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3.gSO4濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Mg2+是金屬離子當(dāng)中較為重要的一種，它是許多酶活性中心不可缺少的一部分，結(jié)果表明MgS04的最適濃度為0.02g/100ml,超過(guò)0.02g/100ml會(huì)抑制酶的活性。

圖2.1 MgSO4濃度對(duì)β-葡聚糖酶產(chǎn)酶的影響

2.4.H2PO4的濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在添加的營(yíng)養(yǎng)鹽中，對(duì)KH2PO4的濃度高低是否影響β-葡聚糖酶的酶活進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，圖2-2表明，高濃度的KH2PO4對(duì)β-葡聚糖酶的酶活有抑制作用，KH2PO4濃度最佳量為0.002（g/l00ml）。

2.5.aC03濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

鈣一般不參與微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，但它是某些酶的激活劑，而且鈣離子能調(diào)節(jié)細(xì)胞透性，對(duì)β-葡聚糖酶也有一定的激活作用[5]。從圖2-3可以看出，CaC03的最適濃度0.05g/100ml.

圖2.3 CaCO3濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

2. 6正交試驗(yàn)確定最佳碳氮比及最佳培養(yǎng)基配方

本實(shí)驗(yàn)選擇了大麥粉、玉米粉、豆粕粉,MgS04, CaC03濃度進(jìn)行五因素四水平的正交試驗(yàn)[6]。由表2-3可知，大麥粉濃度是影響最顯著的因素，五個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的顯著性依次為A>C> B>D>E，最佳條件分別為A3B3C4D3E3，即最適濃度(g/l00ml)為大麥粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05。按此方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)β-葡聚糖酶活力達(dá)到56.53U/ml，是初始產(chǎn)酶條件的1.8倍.

表2.3培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

3. 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌突變株Bacillus subtilis spp.搖瓶分批發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，得出其最佳培養(yǎng)基配方為(g/100ml): 大麥粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05; 糊精、大麥粉等多糖有利于突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶的產(chǎn)生，葡萄糖、蔗糖等易利用性碳源不利于菌體生物量的積累和β-葡聚糖酶的產(chǎn)生。酵母粉為突變株Bacillus subtilis spp.產(chǎn)β-葡聚糖酶的最佳氮源，其次為豆餅粉;試驗(yàn)中選用的無(wú)機(jī)氮源均不利于β-葡聚糖酶的產(chǎn)生。MgS04和CaCO3濃度對(duì)β-葡聚糖酶的產(chǎn)生有較大影響，而KH2PO4濃度對(duì)β-葡聚糖酶的產(chǎn)生影響較小。突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶產(chǎn)生受大麥β-葡聚糖的誘導(dǎo)作用。

[1]趙斌,何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[2]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986.

[3]楊汝德，現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社,2001,157-158.

[4]萬(wàn)平平,丁愛(ài)云,李安娜,黃玉杰. 產(chǎn)β-葡聚糖酶鏈霉菌菌株的篩選及其酶特性研究[J].煙臺(tái)師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）2004,20(1),58-61.

[5]孫玉英，王瑞明，劉慶軍.局限曲霉產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].飼料工業(yè)，2004, 25(1): 29-30.

[6]孫玉英，王瑞明，劉慶軍.局限曲霉產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].飼料工業(yè)，2004, 25(1): 29-30.