譚 瑩 ，譚慶華

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫(yī)院內(nèi)二科，廣東深圳 518000；2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡科，貴州貴陽 550004）

隨著內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)的進步，對某些胃腸道黏膜病變及黏膜下表淺病變，可行內(nèi)鏡下電切術(shù)，完全摘除病變[1]。術(shù)后局部隨即形成潰瘍，當潰瘍完全愈合后，才真正達到臨床治愈的目的。 結(jié)締組織生長因子（connective tissuegrowth factor，CTGF）具有促進細胞增殖、合成膠原等諸多生理作用[2]；而表皮生長因子與其受體（epidermalgrowth factor receptor，EGF-R）結(jié)合形成二聚體，啟動相應的信號轉(zhuǎn)導通路，促進細胞有絲分裂，促進損傷組織的修復[2]。電切術(shù)后的一段時間內(nèi)，臨床上常經(jīng)驗性給予抗菌治療以減少術(shù)后創(chuàng)面感染的發(fā)生。但常規(guī)使用抗生素是否有利于黏膜創(chuàng)面的修復？本文觀察大鼠結(jié)腸黏膜電切術(shù)后創(chuàng)面自然愈合的過程及抗菌治療過程中CTGF和ERF-R的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用成年的健康SD大鼠共48只（貴州省貴陽醫(yī)學院實驗動物中心），雌雄各半，體重（200±13）g。飼養(yǎng)標準棒狀飼料，自由飲水，室溫（23±2）℃，實驗前適應性喂養(yǎng)1周。平均隨機分為4組:①正常組；②手術(shù)未治療組；③手術(shù)治療組；④假手術(shù)組。

1.2 動物模型

術(shù)前24 h禁食，8 h禁飲。腹腔內(nèi)注射麻醉劑（10%水合氯醛3～6 ml/kg）后，無菌操作下取下腹正中切口入腹腔，將膨大的盲腸部鉗拉出腹腔外，在盲腸遠端的結(jié)腸側(cè)切開腸管，切口長約5 mm，在距切口約5 mm處的結(jié)腸黏膜下注射生理鹽水至黏膜隆起，用單極電刀（CHR-ⅢE型，武漢春光醫(yī)療美容儀器有限公司，中國）電切隆起的結(jié)腸黏膜大小約3 mm×3 mm。關(guān)閉腸管、腹腔、消毒、包扎，所有動物術(shù)后禁食、禁水24 h。假手術(shù)組只切開腸管，不行黏膜電切術(shù)，其余同手術(shù)治療組。

1.3 動物給藥

手術(shù)治療組用0.08%的鹽酸左氧氟沙星[0.018g/（kg·d），國藥準字H19990324，揚子江藥業(yè)集團有限公司，中國]和0.92%的甲硝唑[0.047g/（kg·d），國藥準字 H10930165，山西仟源制藥有限公司，中國]腹腔內(nèi)注射，分組持續(xù)注射至術(shù)后第4、7、12天；手術(shù)未治療組、假手術(shù)組均采用等劑量的生理鹽水腹腔注射；正常組予以常規(guī)飼養(yǎng)，不予以腹腔注射給藥。各組其余實驗條件相同，于相應時間用離斷頸椎法處死大鼠，留取電切術(shù)局部腸管，正常組和假手術(shù)組留取相應部位的腸管，用10%中性福爾馬林液固定24 h后常規(guī)石蠟包埋、切片備用。

1.4 免疫組化法檢測CTGF、EGF-R（SABC 法）

用煮沸法修復抗原，修復液為0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）。 一抗分別為 Rabbit Anti-CTGF、Rabbit Anti-EGFR（武漢博士德生物工程有限公司，中國），1∶100稀釋。生物素化二抗為兔抗大鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司，中國），DAB顯色試劑盒（AR1022，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國）室溫顯色20 min后，蒸餾水洗滌以終止反應，蘇木素輕度復染1 min，水洗，脫水、透明、中性樹膠封片觀察。各組設(shè)陰性對照。

1.5 結(jié)腸黏膜CTGF和EGF-R 的半定量測定

各組大鼠腸壁組織經(jīng)免疫組化染色后于400倍光鏡下，對每張切片隨機選擇5個視野照像后，用圖像分析法測定每個視野中CTGF、EGF-R的積分光密度值（IOD），取其平均值作為每張切片的CTGF、EGF-R的IOD值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 各組動物結(jié)腸組織中CTGF 的測定

在正常組大鼠中，CTGF陽性染色主要在結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性，主要集中在大腸腺體的頂端，其基底部幾乎為陰性。手術(shù)未治療組和假手術(shù)組除了上述部位陽性染色外，黏膜下層的結(jié)締組織的成纖維細胞胞漿也出現(xiàn)陽性染色。經(jīng)鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑聯(lián)合給藥治療后，CTGF陽性染色出現(xiàn)在黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿和黏膜下層的結(jié)締組織的成纖維細胞胞漿中，且染色強度明顯高于假手術(shù)組及手術(shù)未治療組，見圖1。

在同一時間點上的不同組間相比，術(shù)后第4天手術(shù)治療組的IOD值較正常組、手術(shù)未治療組、假手術(shù)組都明顯升高（P＜0.05）。術(shù)后第12天假手術(shù)組和手術(shù)未治療組的IOD值較正常組明顯升高（P＜0.05），且手術(shù)未治療組又明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），見表1。

在同一組內(nèi)的不同時間相比，正常組的IOD值各時間點之間無明顯差異（P＞0.05）。手術(shù)未治療組和假手術(shù)組均在術(shù)后第12天達最大值，明顯高于術(shù)后第4天和第7天 （P＜0.05）。 手術(shù)治療組在術(shù)后4d達最大值（P＜0.05），第7天降至正常水平，與正常組無顯著性差異（P＞0.05）。同組內(nèi)第7天和第12天相比無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組動物結(jié)腸組織中EGF-R 的測定

在正常組大鼠中，EGF-R陽性表達主要位于結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性染色。手術(shù)治療組、手術(shù)未治療組及假手術(shù)組EGF-R主要表達在局部組織的黏膜層單層柱狀上皮細胞、杯狀細胞的胞漿及黏膜下層的血管內(nèi)皮細胞胞漿中。其中手術(shù)治療組的染色強度較正常組、假手術(shù)組及手術(shù)未治療組明顯增強。見圖2。

在同一時間點上的不同組間比較，術(shù)后第4天手術(shù)治療組的IOD值較正常組、手術(shù)未治療組、假手術(shù)組都明顯升高(P＜0.05)；手術(shù)治療組術(shù)后第7天仍明顯高于其他各組 (P＜0.05)，到術(shù)后第12天回落至正常組水平(P＞0.05)。術(shù)后第12天假手術(shù)組和手術(shù)未治療組的IOD值較正常組明顯升高 (P＜0.05)，且手術(shù)未治療組又明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，術(shù)后第4、7天的假手術(shù)組、手術(shù)未治療組與正常組無顯著性差異(P＞0.05)，見表2。

表1 CTGF在各組大鼠結(jié)腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.1 IOD of CTGF positive stain in tissue of rat colon(±s)

表1 CTGF在各組大鼠結(jié)腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.1 IOD of CTGF positive stain in tissue of rat colon(±s)

與正常組比較，*P＜0.05；術(shù)后第4天手術(shù)治療組與正常組、手術(shù)未治療組及假手術(shù)組相比，△P＜0.05；術(shù)后第12天假手術(shù)組及手術(shù)未治療組與正常組比較，▲P＜0.05；同組內(nèi)與其他兩個時間點相比，▼P＜0.05Compared with normal controlgroup,*P＜0.05;compared with shamgroup and untreatedgroup on the 4thday,△P＜0.05;compared with normal controlgroup and untreatedgroup on the 12thday,▲P＜0.05;compared with others time point in a samegroup,▼P＜0.05

組別例數(shù)12 12 12 12正常組假手術(shù)組手術(shù)未治療組手術(shù)治療組第4天2 072.05±678.01 1 269.85±259.56▼1 136.90±439.74*▼2 838.54±931.23*△▼第7天1 647.27±462.78 1 407.62±331.47 1 752.45±603.75*1 245.65±327.55*第12天1 680.79±670.96 2 452.44±831.12▲3 912.71±1214.67*▲1 058.69±440.29*

在同一組內(nèi)的不同時間相比，正常組的IOD值各時間點之間無顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)聯(lián)合給藥后，手術(shù)治療組的IOD值在術(shù)后第4天達高峰，較同組內(nèi)第7天和第12天明顯升高 (P＜0.05)，術(shù)后第7天又高于術(shù)后第12天 (P＜0.05)。手術(shù)未治療組和假手術(shù)組的IOD值均在術(shù)后第12天達最大值，均較同組內(nèi)第4天和第7天明顯增加(P＜0.05)。見表2。

3 討論

內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（endoscopic mucosal resection,EMR）和內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosaldissection,ESD）已成為消化道癌前病變和早期癌的重要治療手段[1-3]。而術(shù)后暴露于腸內(nèi)容物的創(chuàng)面，可能繼發(fā)感染，延遲其愈合，所以術(shù)后臨床上常給予抗生素治療。

在切除病變的局部將形成黏膜及黏膜下組織的缺損，而創(chuàng)面愈合涉及到壞死物質(zhì)的清除、基底部肉芽組織的生長、纖維組織和瘢痕組織的生長、新生血管的生成、單層柱狀上皮的長入、上皮的重構(gòu)等過程。在這一過程當中會有包括CTGF和EGF等一系列的細胞因子參與[3-4]。

表2 EGF-R在各組大鼠結(jié)腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.2 IOD of EGF-R positive stain in tissue of rat colon(±s)

表2 EGF-R在各組大鼠結(jié)腸組織中陽性染色的IOD（±s）Tab.2 IOD of EGF-R positive stain in tissue of rat colon(±s)

與正常組比較，*P＜0.05；術(shù)后第4天及第7天手術(shù)治療組與正常組、手術(shù)未治療組及假手術(shù)組相比，△P＜0.05；術(shù)后12天假手術(shù)組和手術(shù)未治療組與正常組比較，▲P＜0.05；同組內(nèi)與其他2個時間點相比，▼P＜0.05compared with normal controlgroup,*P＜0.05;compared with untreatedgroup and shamgroup on the 4thday and 7thday,△P＜0.05;compared with normal controlgroup on the 12thday,▲P＜0.05;compared with others time point in a samegroup,▼P＜0.05

組別例數(shù)12 12 12 12正常組假手術(shù)組手術(shù)未治療組手術(shù)治療組第4天103.84 ±36.48 97.33 ±23.32 105.27 ±79.61*314.71 ±128.37*△▼第7天100.53 ±46.79 129.99 ±86.16 120.41 ±75.54*218.27 ±110.80*△第12天65.94 ±20.47 154.03 ±70.10▲▼304.86 ±128.40*▲▼111.22 ±86.38*

CTGF可刺激成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）生成，參與機體組織的創(chuàng)傷修復及器官纖維化形成的過程[2]。本實驗結(jié)果顯示，正常組的CTGF陽性染色主要在結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，呈弱陽性表達，且主要集中在大腸腺體的頂端,而在基底部幾乎為陰性。這說明少量的黏膜淺層單層柱狀上皮細胞分泌的CTGF即可以確保腸壁內(nèi)結(jié)締組織的生理性更新，使得結(jié)締組織中的相關(guān)成分處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，而且這一生理過程主要由黏膜淺層的上皮細胞參與調(diào)節(jié)。

CTGF不僅促進潰瘍修復過程中的纖維化過程，而且在瘢痕組織的重建或改建過程中起著更重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用由潰瘍及周邊結(jié)締組織中的CTGF和黏膜層單層柱狀上皮細胞中的CTGF協(xié)同完成。其機制可能是一方面通過誘導成纖維細胞的增殖和細胞外的合成，介導細胞黏附，刺激細胞遷移，參與結(jié)締組織的再生、肉芽組織的形成。另一方面通過誘導血管內(nèi)皮細胞的增殖，促進微血管的形成，參與結(jié)構(gòu)的重建[5]。手術(shù)治療組、手術(shù)未治療組和假手術(shù)組在黏膜層柱狀上皮細胞的胞漿和黏膜下層結(jié)締組織中明顯增強的CTGF染色表明，CTGF可能通過誘導成纖維細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的合成，參與結(jié)締組織的再生、肉芽組織的形成和機化。

通過對CTGF的IOD值分析發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組和手術(shù)未治療組的結(jié)腸黏膜電切損傷后，在不做其他任何處理的情況下，術(shù)后7d內(nèi)對上皮細胞合成和分泌CTGF無明顯影響。而在術(shù)后12d手術(shù)造成的創(chuàng)傷可能引起了機體自身修復反應的增強，此時CTGF分泌的增高是調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復的重要環(huán)節(jié)，這種反應使得上皮細胞合成和分泌CTGF的功能在第12天變得最強。術(shù)后第12天手術(shù)未治療組CTGF值較同時間的假手術(shù)組明顯增高，充分說明了額外的黏膜電切損傷，明顯增強了上皮細胞合成和分泌CTGF的功能，黏膜電切這一有效而確定的損傷和刺激引起了機體相應的修復反應。

相對于正常組、假手術(shù)組和手術(shù)未治療組而言，手術(shù)治療組CTGF值的明顯升高和其峰值的前移 （術(shù)后第4天）說明，鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑的干預，使得與CTGF相關(guān)的機體修復反應明顯提前到術(shù)后第4天，這可能與這兩種抗生素的抗菌效應所形成的一個腸道近于無菌的環(huán)境，增強了這一代償、修復機制有關(guān)，即在抗菌治療后，黏膜創(chuàng)面的感染減輕，由此出現(xiàn)的較輕炎癥反應以及較少的炎癥介質(zhì)的釋放，減輕了黏膜的損傷，更有利于上皮的增生和修復。

表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）主要由頜下腺及十二指腸Brunner腺分泌。在生理情況下，EGF由唾液直接進入消化道或由十二指腸Brunner腺直接分泌入小腸而發(fā)揮其對消化道黏膜的生物效應。在胃腸道的任何部位如果形成潰瘍，能誘導干細胞形成新的EGF分泌細胞體系，分泌大量EGF，從而刺激細胞增殖、再生，修復潰瘍[10]。EGF必須與細胞膜表面的表皮生長因子受體 （epidermalgrowth factor receptor，EGFR）結(jié)合才能發(fā)揮其生物學作用，促進上皮細胞、間質(zhì)細胞的生長，增加黏膜細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，增加黏膜血流，促進黏液分泌，刺激組織生長修復，保護胃腸黏膜，促進急慢性損傷的愈合等[6]。

在正常組大鼠的結(jié)腸黏膜上皮細胞中EGF-R的弱陽性染色，可能是大鼠腸黏膜上皮細胞的生理性更新，維持腸黏膜正常的完整性和腸黏膜上皮細胞正常的吸收功能所必需的。從各組動物的結(jié)果顯示，EGF-R陽性表達主要位于結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細胞的胞漿中，看來無論是結(jié)腸黏膜生理性更新，還是外源性損傷后的修復，對結(jié)腸黏膜組織中與EGF-R相關(guān)的修復反應，其黏膜淺層的上皮細胞應該起到最重要的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，EGF腔內(nèi)應用可誘導小腸黏液杯狀細胞分泌黏液，保護鼠腸黏膜免受油酸誘導的損傷[7]。手術(shù)治療組、手術(shù)未治療組及假手術(shù)組的EGF-R主要表達在潰瘍局部組織的黏膜層單層柱狀上皮細胞、杯狀細胞及黏膜下層的血管內(nèi)皮細胞胞漿中，且染色明顯加深。由于EGF-R參與調(diào)節(jié)正常上皮細胞的分化、增殖、上皮細胞間黏附及接觸抑制，當上皮細胞更新旺時，EGF-R表達增加，而當創(chuàng)傷被修復或上皮細胞的更新完成后，其表達明顯降低[6]，這可能是術(shù)后手術(shù)治療組、手術(shù)未治療組和假手術(shù)組的EGF-R明顯升高的原因。說明電切術(shù)后增加的EGF-R可能促進了杯狀細胞分泌黏液，促進新生血管的形成，增加黏膜血流量，刺激組織生長及修復，從而加快了潰瘍的愈合，維持了結(jié)腸黏膜的完整性。

假手術(shù)組和手術(shù)未治療組的EGF-R值在術(shù)后第4、7天沒有明顯的變化，而在術(shù)后第12天達到高峰，說明手術(shù)創(chuàng)傷可引起EGF-R表達的增加，其引起的機體自身修復反應在7d內(nèi)無明顯變化，12d時變化最明顯。從結(jié)果看，可能是黏膜電切術(shù)引起了更強的自身修復反應，所以假手術(shù)組和手術(shù)未治療組的EGF-R值雖然均在術(shù)后第12天達最高峰，但手術(shù)未治療組卻較假手術(shù)組明顯升高。

同CTGF的變化相似，在手術(shù)治療組術(shù)后第4天EGF-R值增加達最高峰；不同的是術(shù)后第7天雖有下降趨勢，但仍明顯高于同時間的其他各組，直至術(shù)后第12天才慢慢回落至正常水平。這說明抗菌治療在抑制炎癥反應、減少炎癥因子的釋放、保護黏膜免受損傷的同時[8]，不僅可使創(chuàng)傷部位結(jié)締組織的修復反應提前，也可使上皮組織的修復明顯提前。由于EGF-R的高表達，促進了結(jié)腸黏膜上皮細胞的增殖和再生，減輕炎癥損傷，同時增加黏膜杯狀細胞合成和分泌黏液，加快了潰瘍愈合[9]。到術(shù)后第12天，上皮組織的這種修復反應在潰瘍表面得以初步修復后，EGF-R的合成和分泌才通過一定的機制回落到正常生理狀態(tài)時的水平。

潰瘍的愈合包括上皮、細胞外基質(zhì)、黏膜上層和更深層組織的重建，是一個上皮細胞增殖、遷移和結(jié)締組織填補黏膜缺損的主動過程。腸黏膜上皮損傷的修復需要黏膜重建和再生。重建可能是早期黏膜修復的一個關(guān)鍵步驟，其重要過程是細胞遷移即從損傷周圍完好的上皮細胞移行覆蓋到鄰近的損傷表面，重塑黏膜屏障的完整性。再生過程包括增殖和分化[10]。本實驗結(jié)果顯示，在手術(shù)治療組中CTGF和EGF-R的表達高峰均在術(shù)后第4天。在術(shù)后第7天，CTGF恢復到正常水平，而EGF-R仍明顯高于正常組，此說明在給藥后，腸黏膜損傷后的修復，無論是結(jié)締組織修復的相關(guān)反應，還是上皮組織修復的相關(guān)反應，都在術(shù)后第4天最明顯。

綜上所述，大鼠結(jié)腸黏膜電切術(shù)后，機體自身的黏膜修復反應可能在術(shù)后第7天內(nèi)無明顯反應，術(shù)后第12天變得最明顯。在給予鹽酸左氧氟沙星及甲硝唑治療后，結(jié)腸黏膜損傷后的結(jié)締組織修復和上皮組織修復都在術(shù)后第4天最明顯。隨著CTGF的明顯下降，結(jié)締組織修復已基本完成，而上皮組織修復仍然很明顯。給藥后可使修復反應的時間提前，且作用明顯增強，有助于創(chuàng)面的愈合，但最佳用藥時間長短仍有待于進一步研究證實。

[1]Yoshida N,Yagi N,Naito Y,et al.Safe procedure in endoscopic submucosaldissection for colorectal tumors focused on preventing complications[J].World Jgastroenterol,2010,16(14):1688-1695.

[2]Tarnawski A,Szabo IL,Husain SS,et al.Regeneration ofgastric mucosaduring ulcer healing is triggered bygrowth factors and signal transduction pathways[J].J Physiol Paris,2001,95(1-6):337-344.

[3]姜泊.染色內(nèi)鏡和放大內(nèi)鏡技術(shù)是提高早期大腸癌診治水平的重要手段[J].第一軍醫(yī)大學學報,2002,22(5):385-387.

[4]李益農(nóng),陸星華.消化內(nèi)鏡學[M].2版.北京:科學出版社,2004:484.

[5]Matsuda S,Gomi F,Oshima Y,et al.Vascular endothelialgrowth factor reduced and connective tissuegrowth factor induced by triamcinolone in ARPE19 cel ls under oxidative stress [J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(3):1062-1068.

[6]Huang BR,Cai LW,Xiang XZ.The basic and applied study on the epidermalgrowth factor[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao,2001,23(2):176-180.

[7]Ishikawa S,Cepinskasg,Specian RD,et al.Epidermalgrowth factor attenuates jejunal mucosal injury induced by oleic acid:role of mucus[J].Am J Physiol,1994,267(6 Pt 1):G1067-G1077.

[8]HarveyRJ,WallworkBD,LundVJ.Anti-inflammatoryeffectsof macrolides:applications in chronic rhinosinusitis [J].Immunol Allergy Clin North Am,2009,29(4):689-703.

[9]王雪茜,王新月,楊莉莉.不同給藥途徑對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜EGF表達的影響[J].世界華人消化雜志,2006,14(29):2872-2875.

[10]蘇華芳,江松福,俞康.三葉肽在胃腸黏膜重建中的作用研究進展[J].國際消化病雜志,2007,27(2):87-89.