王青，陳潔，潘景業(yè)

(溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心；2.附屬第一醫(yī)院 ICU)

多年來，國內(nèi)外關(guān)于休克的研究主要集中在炎癥因子和抗炎治療上。由于炎癥與機(jī)體的凝血和抗凝血的動態(tài)平衡關(guān)系密切，抗凝也逐漸成為休克治療新的靶點(diǎn)[1]。本實(shí)驗(yàn)觀察了失血性休克時(shí)肝臟組織的組織因子(tissue factor，TF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)、組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，t-PA)和纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等參與凝血、纖溶過程的物質(zhì)的表達(dá)情況，以及參附注射液的干預(yù)作用，為臨床上對失血性休克的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組：清潔級健康SD大鼠40只，雌雄不拘，雌鼠不孕，體重250～300 g。由中國科學(xué)院上海分院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物先置溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心層流實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2 d，自由攝食、攝水，室內(nèi)溫度25 ℃，相對濕度70%，12/12 h晝夜照明變化。大鼠隨機(jī)分對照組、休克組、林格液組、參附液組。若因模型不成功、死亡造成各亞組樣本量不足8只的，按隨機(jī)原則補(bǔ)足。

1.1.2 主要試劑：參附注射液購于江蘇先聲藥業(yè)公司(國藥準(zhǔn)字號:H33020465)；Trizol Reagent試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒由Fermantas公司提供；引物及內(nèi)參均由上?；倒咎峁?。

1.2 模型的建立及處理 實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水，操作前稱重，在暖燈照射下進(jìn)行操作。按4 mL/kg腹腔注射20%烏拉坦麻醉。①對照組：麻醉后分離左側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸外靜脈。用22-18 G動脈穿刺針行動脈插管，整個(gè)管道系統(tǒng)預(yù)充生理鹽水液。動脈插管經(jīng)三通及壓力傳感器連接多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測平均動脈壓。在右側(cè)頸外靜脈穿刺、插管，后者用于輸液。不予其他操作，于插管后3 h，取肝臟組織標(biāo)本。②休克組：按參考文獻(xiàn)[2]的方法，復(fù)制失血性休克動物模型。插管成功后，15 min內(nèi)放血使平均動脈壓降至5.33 kPa(40 mmHg)，穩(wěn)定60 min，使其波動范圍在（40±5）mmHg，即為模型復(fù)制成功；于2 h后取肝臟組織標(biāo)本。③林格液組：模型復(fù)制成功后30 min內(nèi)輸注3倍失血量的林格液治療，2 h后取肝臟組織標(biāo)本。④參附液組：補(bǔ)液方案為參附注射液10 mL/kg，再輸入林格液補(bǔ)充至3倍失血量，所有液體在30 min內(nèi)輸完；2 h后取肝臟組織標(biāo)本，于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 RT-PCR檢測肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA含量 ①引物設(shè)計(jì)：大鼠各基因序列可在NCBI找到。采用Primer5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)PCR所用引物，最后用BLAST驗(yàn)證。②Trizol試劑盒一步法分離提取總RNA：按照Invitrogen公司提供的Trizol試劑盒說明書步驟進(jìn)行。③逆轉(zhuǎn)錄：將提取的總RNA取一部分立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。參考Takara公司提供的說明書進(jìn)行操作。④PCR反應(yīng)參考Takara公司提供的說明書進(jìn)行操作，并按比例調(diào)整反應(yīng)體系體積。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算機(jī)成像后以Gel3.0軟件分析電泳圖像的各mRNA相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 多組間相同指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用Student Newman Keuls法，方差不齊同者采用Tamhane’s T2法。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)結(jié)果 休克組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)與對照組相比明顯升高，差異均有顯著性（均P<0.05）；林格液組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)較對照組及休克組升高，差異均有顯著性(均P<0.05)；參附液組肝臟組織TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)與對照組比較，差異無顯著性，與休克組及林格液組比較明顯降低(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組肝臟TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA的表達(dá)及比較 (n=8±s)

表1 各實(shí)驗(yàn)組肝臟TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA的表達(dá)及比較 (n=8±s)

與對照組比：▲P<0.05；與休克組比：☆P<0.05；與林格液組比：★P<0.05

組別對照組休克組林格液組參附液組F值TF mRNA 0.70±0.21 1.05±0.18▲1.27±0.33▲☆0.82±0.22☆★9.22 TM mRNA 0.80±0.20 1.03±0.26▲1.25±0.25▲☆0.81±0.18☆★6.06 t-PA mRNA 0.69±0.16 0.98±0.18▲1.17±0.24▲☆0.79±0.22☆★10.80 PAI-1 mRNA 0.78±0.25 1.04±0.29▲1.30±0.32▲☆0.79±0.21☆★6.98

圖1 各組TF mRNA，TM mRNA，t-PA mRNA，PAI mRNA的表達(dá)變化

3 討論

嚴(yán)重創(chuàng)傷病人易發(fā)生DIC，其中內(nèi)皮細(xì)胞起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞不僅是創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的參與者，還是首先受損的靶細(xì)胞。肝臟是一個(gè)高血流的器官，血管內(nèi)皮細(xì)胞豐富，在創(chuàng)傷失血性休克時(shí)易出現(xiàn)功能損傷。內(nèi)皮細(xì)胞具有表達(dá)TF啟動外源性凝血途徑，且同時(shí)又分泌TM發(fā)揮抗凝的作用，分泌t-PA激活纖溶及PAI-1發(fā)揮抗纖溶的功能。內(nèi)皮細(xì)胞受損后，調(diào)節(jié)凝血、抗凝的功能下降，使機(jī)體凝血-抗凝系統(tǒng)紊亂，微循環(huán)產(chǎn)生障礙。TF的表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切。TM是一種內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白，是經(jīng)典的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一個(gè)分子標(biāo)志物[5]。t-PA和PAI是調(diào)節(jié)纖溶活性的關(guān)鍵物質(zhì)，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成。t-PA為絲氨酸蛋白酶，能選擇性地活化血凝塊中的纖溶酶原生成纖溶酶，進(jìn)而使纖維蛋白水解，血流通暢；PAI是t-PA最重要的抑制物，二者形成1:1復(fù)合物，使t-PA失去活性[6]，有內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，t-PA和PAI-1大量釋放。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)失血性休克大鼠肝臟組織中TM，TF，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與Besbas等[7]認(rèn)為TM，t-PA，和PAI-1水平的升高反映內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和纖溶系統(tǒng)的激活頗相似。本實(shí)驗(yàn)林格液治療后TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)較創(chuàng)傷對照組及休克組明顯升高，提示林格液干預(yù)未見明顯改善，反而有惡化作用，可能與缺血再灌注致內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。參附注射液是由紅參、附片等藥提取物混合而成，能夠穩(wěn)定血流動力學(xué)，減輕肺缺血/再灌注[2]，增強(qiáng)機(jī)體非特異性抵抗力，抗休克雙向調(diào)節(jié)血壓。參附液復(fù)蘇組與休克組及林格液復(fù)蘇組比較，TF，TM，t-PA，PAI-1 mRNA表達(dá)明顯降低，提示組織及內(nèi)皮細(xì)胞損傷后恢復(fù)且其對肝臟內(nèi)皮細(xì)胞凝血、纖溶因子的表達(dá)產(chǎn)生影響，不易形成血栓，保持血管內(nèi)血流通暢，改善微循環(huán)，同時(shí)，又防止纖溶過度亢進(jìn)。有報(bào)道稱，用參附注射液治療大鼠肝缺血再灌注，發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯減輕，肝竇形態(tài)的改變和肝竇內(nèi)的瘀血、白細(xì)胞聚集也明顯減輕，也提示參附注射液通過保護(hù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，改善肝臟微循環(huán)灌注[8]。

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