槐雅萍,楊永軒,賈子善,郭宗成,賈新鳳

本文要點(diǎn)

1 探索學(xué)習(xí)大鼠腦梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)在造模后第7、14天明顯多于手術(shù)對照組,提示探索學(xué)習(xí)可能通過增強(qiáng)腦梗死大鼠巢蛋白的表達(dá),來保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧損傷,促進(jìn)腦功能的重組。

2 除大腦室管膜下區(qū)、海馬齒狀回外,海馬 CA1～4區(qū)、缺血灶周圍皮質(zhì)也可見巢蛋白的表達(dá)。推測腦缺血損傷可能刺激腦內(nèi)成熟的間質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞返回到神經(jīng)干細(xì)胞狀態(tài),重新分化成神經(jīng)元。

3 探索學(xué)習(xí)與突出素的表達(dá)呈正相關(guān);大鼠經(jīng)過探索學(xué)習(xí)訓(xùn)練,隨著時間的延長,突出素的反應(yīng)產(chǎn)物明顯增多。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化是康復(fù)治療的機(jī)制之一。半個世紀(jì)前,就有學(xué)者提出神經(jīng)皮質(zhì)的連接可因個體的經(jīng)歷 (如學(xué)習(xí)、感覺刺激、物理刺激等)而發(fā)生改變,腦功能代表區(qū)的改變也是如此。探索學(xué)習(xí)是指動物主動去接受新的信息而改變自身行為、適應(yīng)新環(huán)境的過程,是不斷用新記憶取代舊記憶的過程[1],主要用來訓(xùn)練動物的學(xué)習(xí)、記憶、空間辨別、覓食等本能性行為能力,促進(jìn)受損的行為學(xué)功能的恢復(fù)。有研究表明探索學(xué)習(xí)能明顯促進(jìn)腦梗死大鼠的行為學(xué)恢復(fù)[2],但對腦卒中后行為學(xué)能力恢復(fù)的分子作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬觀察探索學(xué)習(xí)對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白 (nestin)及突觸素 (synaptophysin,SYP)表達(dá)的影響,探討探索學(xué)習(xí)對腦梗死后功能恢復(fù)影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性 SD大鼠 70只,3～4月齡,體質(zhì)量 230～260 g,購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部。合格證號 SCXK(鄂)2004—0007。將動物隨機(jī)分為大腦中動脈栓塞 (MCAO)模型組60只,假手術(shù)組 10只。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉購自上海生工公司;多聚甲醛(分析純)購自天津市化學(xué)試劑研究所;兔抗大鼠巢蛋白多克隆抗體購自北京中杉金橋;小鼠抗大鼠突觸素多克隆抗體購自武漢博士德;筆式高溫電灼器 (北京貝林電子有限公司);手術(shù)顯微鏡 (德國 Leica公司);光學(xué)顯微鏡 (日本 OLYMPUS公司);圖像分析管理系統(tǒng) (美國 Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

1.3.1 制備 MCAO模型及分組 參照 Bederson等[3]的方法制備 MCAO模型。術(shù)后 24 h將大鼠隨機(jī)分為探索學(xué)習(xí)組 30只,手術(shù)對照組 30只。假手術(shù)組 10只,不電凝大腦中動脈,其余步驟與手術(shù)組相同。

1.3.2 造模后飼養(yǎng)環(huán)境 (1)假手術(shù)組:飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠,每籠 5只。(2)手術(shù)對照組:飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠,每籠 5只。(3)探索學(xué)習(xí)組:15只一組,飼養(yǎng)于由一個圓籠和一個方籠組成的迷宮籠[2]。直徑 500 mm的圓籠與 640 mm×480 mm×120 mm的方籠中間通過兩通道相連 (圓籠:中間由絲網(wǎng)分隔,一側(cè)為進(jìn)食區(qū),一側(cè)為飲水區(qū);方籠:由絲網(wǎng)分隔形成通道寬80 mm×80 mm的迷宮,迷宮由易到難,每周變換 1次)。

1.3.3 標(biāo)本的制備 分別于術(shù)后第 1、7、14、28天從手術(shù)對照組和探索學(xué)習(xí)組隨機(jī)取5只大鼠;假手術(shù)組于術(shù)后第7天隨機(jī)取 5只大鼠,第 28天隨機(jī)取 5只大鼠。用 10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺,剪開胸腔,暴露心臟,用 9號針頭插入左心室,灌注 0.9%氯化鈉溶液,待右心耳膨起,剪開右心耳讓血液流出,至右心耳流出液為無色透明時開始用4%多聚甲醛灌注固定,先快后慢,每只大鼠約灌注 300 ml,總量在 20～30 min內(nèi)灌完。固定后立即剖顱取腦,在視交叉處切開,冠狀切取 2 mm厚包含梗死灶區(qū)域及左右半球的組織塊浸于 4%多聚甲醛中再固定 4 h。經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片,切片厚 5μm。

1.3.4 SP法檢測巢蛋白和突觸素的表達(dá) 組織切片常規(guī)脫蠟,水化。PBS沖洗 3次,每次 3 min(3×3 min,下同);0.3%過氧化氫室溫孵育 10 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶;PBS沖洗 2×3 min;熱修復(fù) 30 min;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 A(蛋白阻斷液),室溫孵育 10 min,減少非特異性背景染色;PBS沖洗 3×3 min;滴加一抗 (巢蛋白稀釋比例為1∶400;突觸素稀釋比例為 1∶500),置 20%甘油濕盒 4℃恒溫過夜;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 B(生物素標(biāo)記的二抗),室溫孵育 10 min;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 C(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生素蛋白),室溫孵育 10 min;PBS沖洗 3×3 min;DAB顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.5 染色結(jié)果判定 (1)巢蛋白染色結(jié)果判定:每只大鼠選取 3張切片,每張切片選取 3個 10×40倍視野,用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目。(2)突觸素染色結(jié)果判定:每張切片在梗死灶周圍皮質(zhì)隨機(jī)選取 3個10×40倍視野,用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)在同一光強(qiáng)度下測量其突觸素吸光度 (optical density,OD)值,同時測量同一張切片胼胝體的 OD值作為背景 OD值,用矯正吸光度 (COD,COD=實(shí)測值 -背景值)值進(jìn)行比較和分析,以避免染色過程中非特異性染色所造成的誤差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白表達(dá)的時程變化 光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性細(xì)胞密集。部分巢蛋白陽性細(xì)胞胞體較大呈橢圓形或紡錘形,胞質(zhì)呈棕褐色,有少量突起,細(xì)胞核較大。假手術(shù)組皮質(zhì)神經(jīng)元胞質(zhì)未見巢蛋白陽性表達(dá)。探索學(xué)習(xí)組與手術(shù)對照組梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性細(xì)胞數(shù)在腦梗死后第 1天即有增加,第 7天達(dá)到高峰,染色最深,第 14天和第 28天陽性細(xì)胞逐漸減少,染色變淡。腦梗死后第7天和第 14天,探索學(xué)習(xí)組大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性細(xì)胞較手術(shù)對照組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),而第 28天時兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見表 1、圖 1～3)。

表 1 各組大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)比較 (x±s,×400)Table 1 Expression of nestin in rats among three groups

2.2 梗死灶周圍皮質(zhì)突觸素表達(dá)的時程變化 突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色的點(diǎn)狀或細(xì)顆粒狀物,分布密集,部分呈板層樣分布。有些顆粒圍繞在細(xì)胞周圍,襯托出細(xì)胞輪廓。假手術(shù)組皮質(zhì)可見突觸素呈點(diǎn)狀或顆粒樣。探索學(xué)習(xí)組與手術(shù)對照組梗死灶周圍皮質(zhì)突觸素表達(dá)在造模后第 1天無明顯變化,兩組與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05),兩組之間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。第 7天時突觸素表達(dá)增多,探索學(xué)習(xí)組與手術(shù)對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05),而兩組與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。第 14天時突觸素表達(dá)明顯增強(qiáng),第 28天時最強(qiáng),且顆粒較粗大,并出現(xiàn)深染的顆粒性產(chǎn)物,密集的小顆粒呈帶狀。探索學(xué)習(xí)組突觸素表達(dá)在第 14、28天較手術(shù)對照組增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01,見表 2、圖 4～6)。

表 2 各組大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)突觸素光密度值比較 (x±s, ×400)Table 2 Expression of synaptophysin in rats among three groups

圖 1 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)巢蛋白的表達(dá)Figur e 1 Expression of nestin in cortex in sham group(IHC 400×)

圖 2 手術(shù)對照組大鼠在術(shù)后第 7天時皮質(zhì)巢蛋白陽性表達(dá)情況Figur e 2 Expression of positive nestin neuron in peri-ischemic cortex in control group at 7 day after MCAO(IHC 400×)

圖 3 探索學(xué)習(xí)組大鼠在術(shù)后第 7天時皮質(zhì)巢蛋白陽性表達(dá)情況Figur e 3 Expression of positive nestin neuron in peri-ischemic cortex in learning group at 7 day after MCAO(IHC 400×)

圖 4 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)突觸素表達(dá)情況Figur e 4 Expression of SYN in cortex in sham group(IHC 400×)

圖 5 手術(shù)對照組大鼠在術(shù)后第 28天時皮質(zhì)突觸素表達(dá)情況Figur e 5 Expression of SYN in peri-ischemic cortex in control group at 28 day after MCAO(IHC 400×)

圖 6 探索學(xué)習(xí)組大鼠在術(shù)后第 28天時皮質(zhì)突觸素表達(dá)情況Figur e 6 Expression of SYN in peri-ischemic cortex in learning group at 28 day after MCAO(IHC 400×)

3 討論

3.1 探索學(xué)習(xí)環(huán)境對梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白表達(dá)的影響 近十幾年來,人們發(fā)現(xiàn)在成年腦組織內(nèi)存在具有多種分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC),正常情況下這些細(xì)胞處于靜息狀態(tài),當(dāng)其所處的微環(huán)境發(fā)生改變或在外來信號的刺激下,能自我更新,并在一定條件下分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù),這表明了中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)具有一定的修復(fù)潛能。巢蛋白被認(rèn)為是 NSC的標(biāo)志,已廣泛用于 NSC的鑒定。巢蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的第六類中間絲蛋白,這種蛋白在哺乳動物胚胎期 CNS的神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá),動物出生后其表達(dá)很快降低并消失[4]。但在少數(shù)仍保持神經(jīng)發(fā)生功能的部位 (如大腦室管膜下區(qū)、嗅球、海馬齒狀回)仍有表達(dá)。這些巢蛋白陽性細(xì)胞具有分化和增殖的能力,提示巢蛋白可能參與調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的分化與增殖。

隨著 Reynolds等[5-6]在成體腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 NSC,人們愈來愈認(rèn)識到,NSC在腦損傷修復(fù)中起到了非常重要的作用。大量研究表明,NSC在神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)環(huán)境的調(diào)控下可對因缺血損傷而造成的神經(jīng)功能喪失產(chǎn)生代償和修復(fù)作用[7-8]。在腦缺血的早期即可誘導(dǎo)巢蛋白的表達(dá),從而在腦損傷的修復(fù)中發(fā)揮主要作用[9]。在損傷最重區(qū)域,巢蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目最顯著,故巢蛋白可作為 CNS損傷時最早、快速應(yīng)答的敏感標(biāo)志物;另一方面,巢蛋白是 NSC的特異性標(biāo)記蛋白,NSC具有多分化潛能,可以分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,并能自我更新。巢蛋白的高表達(dá)可能預(yù)示了 NSC的激活,從而在腦損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,探索學(xué)習(xí)組大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)巢蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)量在造模后第 7、14天明顯多于手術(shù)對照組,提示探索學(xué)習(xí)可能通過增強(qiáng)腦梗死大鼠巢蛋白的表達(dá),保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧損傷,促進(jìn)腦功能的重組,從而有利于行為學(xué)的恢復(fù)。

腦缺血不僅可激活 NSC,使 NSC增殖分化,而且也可使缺血灶周圍的某些成熟神經(jīng)元逆轉(zhuǎn)為 NSC。Li等[10]的實(shí)驗(yàn)表明,局灶腦缺血后 6～12 h,缺血灶中心區(qū)的星形細(xì)胞開始表達(dá),隨著時間的推移,缺血灶及周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞也表達(dá)巢蛋白。更為有趣的是,缺血灶附近的一些神經(jīng)元也呈現(xiàn)巢蛋白陽性。顯然這些巢蛋白陽性 NSC并非來源于室管膜下層和齒狀回等區(qū),因?yàn)樗麄兙哂谐墒焐窠?jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的特征,提示這種逆向轉(zhuǎn)化的存在。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),除大腦室管膜下區(qū)、海馬齒狀回外,海馬 CA1～4區(qū)、缺血灶周圍皮質(zhì)也可見巢蛋白的表達(dá)。推測為腦缺血損傷可能刺激腦內(nèi)成熟的間質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞返回到 NSC狀態(tài),重新分化成受損最嚴(yán)重的細(xì)胞類型 (主要是神經(jīng)元),并遷移至損傷的腦區(qū),從而發(fā)揮修復(fù)和重排神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的作用[11]。

腦損傷后,巢蛋白的重新表達(dá)與神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放有關(guān),而不同環(huán)境刺激后,各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平也不同。因此,探索學(xué)習(xí)誘導(dǎo)局灶性腦梗死大鼠海馬巢蛋白表達(dá),可能是探索學(xué)習(xí)促進(jìn)腦梗死后功能恢復(fù)的機(jī)制之一。

3.2 探索學(xué)習(xí)環(huán)境對梗死灶周圍皮質(zhì)突觸素表達(dá)的影響 突觸素是突觸囊泡膜上的一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白[12],是突觸發(fā)生和突觸可塑性的重要標(biāo)志,其參與Ca2+依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)釋放,還參與神經(jīng)元間信息的傳遞[13]。幾乎所有中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前終末內(nèi)均有突觸素,它的表達(dá)可以反映突觸的發(fā)生和密度,并且它通過與 Ca2+的結(jié)合引起神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,還可影響神經(jīng)信息的傳遞和加工。它可作為突觸前終末的特異性標(biāo)記物,用來檢測突觸的密度和分布,是神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)記物之一。突觸素膜含量的高低可反映突觸神經(jīng)功能的高低、突觸的信息傳遞、遞質(zhì)釋放等神經(jīng)生物功能正常與否。因其與神經(jīng)生長、修復(fù)、再生和突觸重塑密切相關(guān),成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

腦功能重組是神經(jīng)康復(fù)的重要理論基礎(chǔ)。CNS具有結(jié)構(gòu)和功能重新組織的能力,特別是在損傷后 CNS具有高度的可塑性。軸突出芽、突觸形成、突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變是腦功能重組重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。腦缺血損傷可致神經(jīng)元功能發(fā)生不同程度的缺損,隨著缺血時間的延長,機(jī)體可通過促進(jìn)突觸素的合成作用,引起突觸結(jié)構(gòu)和功能兩方面的重建。新突觸形成的方式有兩種:(1)未受損神經(jīng)元通過軸突繞道投射,樹突不尋常分叉等方式進(jìn)行突觸重建;(2)海馬齒狀回 NSC增殖、遷移和分化,大量新生神經(jīng)元到達(dá)受損區(qū)域,與周圍神經(jīng)元形成新的突觸連接,以達(dá)到代償目的[14-15],突觸前膜功能在缺血后代償性增加也可使突觸素表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突觸素的免疫活性在第 1天時已有所表達(dá),第 7天時免疫活性增強(qiáng),可能與未受損神經(jīng)元的突觸重建有關(guān);第 14天免疫活性明顯增強(qiáng),第 28天時最強(qiáng),可能與 NSC的增殖、遷移、分化有關(guān)。

許多研究亦表明學(xué)習(xí)是影響腦可塑性的主要因素之一,學(xué)習(xí)會增加突觸的數(shù)量,改變突觸的結(jié)構(gòu)[16]。當(dāng)大鼠經(jīng)水迷宮訓(xùn)練獲得了空間辨別性學(xué)習(xí)記憶功能后,在海馬內(nèi)會引起突觸數(shù)量增多、突觸活性區(qū)膜面積增加、突觸小泡數(shù)量和體積增加等一系列形態(tài)學(xué)變化,這些變化可以認(rèn)為是空間辨別性學(xué)習(xí)記憶在大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)引起了突觸形態(tài)學(xué)的可塑性變化[17],而樹突棘可能是長期突觸可塑性的關(guān)鍵,直接關(guān)系到記憶在大腦的存儲[18]。探索學(xué)習(xí)能夠向中樞神經(jīng)提供大量沖動,有利于突觸聯(lián)系的建立,激活神經(jīng)通路,實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能的重組,從而恢復(fù)正常的功能。隨著探索學(xué)習(xí)模型的建立,探索學(xué)習(xí)的信息不斷傳入腦內(nèi),引起腦內(nèi)突觸的形成或改建。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探索學(xué)習(xí)組大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)的突觸素光密度值在第14、28天較手術(shù)對照組為高,有明顯差別,說明探索學(xué)習(xí)與突觸素的表達(dá)呈正相關(guān)性。同時本研究也發(fā)現(xiàn),大鼠經(jīng)探索學(xué)習(xí)訓(xùn)練,隨著時間的延長,突觸素的反應(yīng)產(chǎn)物明顯增多。探索學(xué)習(xí)引起海馬突觸素表達(dá)增加,這可能是探索學(xué)習(xí)促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)損傷恢復(fù)和功能重組的機(jī)制之一。

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