李翠瑩 安群星 甘新宇 (成都軍區(qū)總醫(yī)院輸血科,成都 610083)

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是一種由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的嚴(yán)重傳染病,迄今仍缺乏特別有效的治療方法。HIV-1輔受體及其基因多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)給AIDS的治療研究帶來新的契機(jī)。CCR5和CXCR4是HIV-1最為主要的輔受體,CCR5輔受體在人群中存在有多種突變,其中CCR5Delta32是一種最常見、也是最重要的輔受體突變形式。據(jù)研究[1-5],CCR5Delta32純合子突變個(gè)體能有效抵制HIV-1感染,其雜合子個(gè)體也不易被HIV-1感染或感染后病程進(jìn)展緩慢。我們從CCR5Delta32突變個(gè)體獲得目的基因并將其克隆至pLenti6/V5-D-TOPO載體,經(jīng)慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),研究目的基因的表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞表面HIV-1輔受體CCR5和CXCR4的抑制作用。這些工作為今后AIDS的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 E.coli DH5α菌株和293T細(xì)胞為本室保存。載體 pUCm-T、pLP1、pLP2、pLP/VSVG 和 pLenti6/V5-D-TOPO均購(gòu)自Invitrogen公司?；蚪MDNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司,膠回收試劑盒購(gòu)自寶信公司,質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自Promega公司。Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶,以及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和 PstⅠ均購(gòu)自 TaKaRa公司。轉(zhuǎn)染試劑GeneCompanionⅡ購(gòu)自GeneTrans公司,培養(yǎng)基DMEM+10%胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。Anti-CD4-FITC、Anti-CCR5-PE和Anti-CXCR4-PE-Cy5購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 從CCR5Delta32突變個(gè)體外周血提取基因組DNA,以其為模板利用設(shè)計(jì)的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pLenti6/V5-D-TOPO載體,隨后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌。堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序。用 pLP1、pLP2、pLP/VSVG 及pLenti-CCR5Delta32四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得重組慢病毒液并測(cè)定其滴度。

1.2.2 重組慢病毒轉(zhuǎn)染PBMCs 用淋巴細(xì)胞分離液從新鮮外周血中提取PBMCs,用10%FCS RPMI1640 培養(yǎng)液(含 10 μ g/ml PHA,100 U/ml rIL-2)培養(yǎng)48小時(shí)。加入包裝好的重組慢病毒液1 ml(5×105TU/ml),加入 polybrene(6 μ g/ml),感染 2 ～ 3 小時(shí)。移除感染上清,加入新培養(yǎng)液(含PHA和rIL-2)培養(yǎng)24小時(shí),觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 Western blot鑒定 裂解轉(zhuǎn)染有目的基因的PBMCs,之后行12%SDS-PAGE,結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。以抗CCR5Delta32兔血清(參照文獻(xiàn)[3]本室自制)為一抗,以鼠抗兔IgG-HRP為二抗,用ECL顯色后觀察結(jié)果。

1.2.4 FACS分析 用PBS調(diào)整經(jīng)轉(zhuǎn)化的PBMCs為1×106個(gè)/100 μ l/管 ,分別加入 20 μ l熒光抗體(Anti-CD4-FITC、Anti-CCR5-PE和Anti-CXCR4-PE-Cy5),4℃避光孵育30分鐘。結(jié)束后加入1.5 ml PBS洗滌2次,用400 μ l 2%多聚甲醛固定后進(jìn)行FACS分析。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 以CCR5Delta32突變個(gè)體基因組DNA為模板PCR得到約650 bp的擴(kuò)增片段。測(cè)序正確后構(gòu)建pLenti-CCR5Delta32質(zhì)粒,用包括pLenti-CCR5Delta32在內(nèi)的四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,產(chǎn)生重組慢病毒,測(cè)定其滴度為5×105TU/ml。

2.2 Western blot鑒定 用Lenti-CCR5Delta32重組慢病毒感染人PBMCs,培養(yǎng)48小時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行 Western blot鑒定。結(jié)果證實(shí),目的蛋白在人PBMCs內(nèi)成功表達(dá)(圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)Fig.1 The expressed proteins were confirmed by Western blot analysis

圖2 FACS分析轉(zhuǎn)染前后 PBMCs表面CCR5輔受體變化Fig.2 FACS analysis of CCR5 expression on human PBMCs before and after transfection with Lenti-CCR5Delta32

圖3 FACS分析轉(zhuǎn)染前后 PBMCs表面CXCR4輔受體變化Fig.3 FACS analysis of CXCR4 expression on human PBMCs before and after transfection with Lenti-CCR5Delta32

圖4 PBMCs內(nèi)CCR5Delta32蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞表面輔受體產(chǎn)生的抑制作用Fig.4 Inhibition of CCR5Delta32 protein on human PBMCs surface expression of coreceptor

2.3 FACS分析 培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的PBMCs,每隔2天對(duì)其表面CCR5和CXCR4輔受體進(jìn)行FACS分析。結(jié)果表明,靶細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞表面輔受體CCR5和CXCR4的產(chǎn)生起抑制作用,抑制率在轉(zhuǎn)染后第6天達(dá)到高峰(CCR5的抑制率為51.69%,CXCR4的抑制率為61.05%),以后維持在此水平(圖2～4)。

3 討論

HIV-1必需與CD4受體及一些必要的輔受體結(jié)合,才能感染進(jìn)入靶細(xì)胞。現(xiàn)已明確,CCR5和CXCR4是HIV-1兩類最為主要的輔受體,其中CCR5輔受體在人群中存在有多種突變。CCR5Delta32是一種最常見,也是最重要的輔受體突變形式。它是由于CCR5輔受體基因在自然進(jìn)化過程中發(fā)生了32個(gè)堿基缺失的突變,即在CCR5基因編碼區(qū)域第185位氨基酸密碼子以后發(fā)生了32個(gè)堿基的缺失,導(dǎo)致開放讀碼框錯(cuò)位,造成蛋白質(zhì)翻譯的提前終止,在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生出一種截短的、無功能的CCR5Delta32突變蛋白。正常CCR5分子量約為46 kD,而這種截短的突變蛋白分子量只有30 kD。據(jù)調(diào)查研究,CCR5Delta32純合子突變個(gè)體能有效抵制HIV-1感染,其雜合子個(gè)體也不易被HIV-1感染或感染后病程進(jìn)展緩慢。通過Hardy-Weinberg測(cè)試及其他研究,這類突變個(gè)體其生理及生殖發(fā)育等方面均未受到任何影響。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在美國(guó)白人和歐洲后裔中,CCR5Delta32等位基因突變率約為10%左右[6,7]。在我國(guó),各民族CCR5Delta32平均突變率還不到0.2%,而且主要為雜合子突變[8]。從遺傳學(xué)角度認(rèn)為,我國(guó)人群普遍對(duì)HIV-1易感。目前,CCR5Delta32突變個(gè)體抗HIV-1感染的機(jī)理已基本清楚,可歸納如下:由于這種突變個(gè)體淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的CCR5Delta32蛋白,通過反式顯性失活(transdominant negative,TDN)效應(yīng)抑制細(xì)胞表面CCR5和CXCR4兩類輔受體的表達(dá),從而阻止了嗜T、嗜M及雙嗜性HIV-1毒株的感染[1,3,9,10]。具體地說,是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的CCR5Delta32突變蛋白,與胞內(nèi)新合成的兩類輔受體通過異源二聚體形式結(jié)合并將之扣押,使其無法到達(dá)細(xì)胞表面。經(jīng)過數(shù)天的新陳代謝,細(xì)胞表面兩類輔受體就會(huì)減少乃至消失,從而達(dá)到抑制各類HIV-1毒株感染的作用。

這個(gè)發(fā)現(xiàn)給AIDS的治療帶來新的契機(jī)。我們擬通過構(gòu)建含CCR5Delta32基因的真核表達(dá)載體,體外轉(zhuǎn)染人PBMCs或造血干細(xì)胞,通過表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)新合成的兩類輔受體(CCR5和CXCR4)結(jié)合并將之扣押在胞內(nèi),從而達(dá)到同時(shí)阻斷嗜T、嗜M及雙嗜性HIV-1毒株感染的目的。

本研究成功地構(gòu)建了重組慢病毒載體pLenti-CCR5Delta32,轉(zhuǎn)染人PBMCs后檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。FACS分析顯示,靶細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞表面輔受體CCR5和CXCR4的產(chǎn)生起抑制作用。這些工作為后續(xù)的AIDS基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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