胡朝英 錢 柳 程偉志 黃秋愉 汪 萍 余奇文 張繼英 陳雪華 張冬青

(上海交通大學醫(yī)學院上海市免疫學研究所,上海 200025)

人類γ δ T細胞據(jù)其δ鏈可分為δ 1和δ 2兩個亞群,δ 1亞群主要分布于外周器官的粘膜和皮下,在不同的組織部位,其數(shù)量不等;δ 2亞群主要存在于外周血中,占T淋巴細胞的0.5%～10%[1,2]。外周血中的γ δ T細胞約占人體總γ δ T細胞的90%以上,且主要取用Vγ 9Vδ 2 TCR基因片段,它能夠直接識別抗原分子而不受MHC分子限制,在固有免疫中發(fā)揮重要作用[3,4]。近年來γ δ T細胞是免疫學的一個研究熱點,國內(nèi)外學者對其分化和功能進行了廣泛深入的研究[5,6],但以動物實驗多見,且集中在抗感染和抗腫瘤等方面[7,8],而有關(guān)人類γ δT細胞的亞型分化及免疫調(diào)節(jié)功能的研究尚處早期。本文旨在應(yīng)用異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate,IPP)誘導(dǎo)健康人外周血和新生兒臍帶血γ δT細胞擴增,分析其不同亞型的分化格局,從而進一步豐富對人類γ δ T細胞異質(zhì)性的認識,為深入研究γ δT細胞與自身免疫病關(guān)聯(lián)性提供實驗依據(jù),更為應(yīng)用γ δT細胞干預(yù)自身免疫性疾病探索其可能性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本實驗所用的人外周血細胞均來自本校健康學生志愿者,共15名,其中男8名,女7名;年齡18～35歲;新生兒臍帶血來自婦幼保健院足月自然分娩健康新生兒結(jié)扎剪斷臍帶后臍靜脈采血。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,BRL);胎牛血清(FBS,Gibco);IL-2(Roche);異戊烯焦磷酸(Sigma);結(jié)核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)由蚌埠醫(yī)學院李柏青教授惠贈;γ δ TCR,CD4,CD8磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec);抗 CD3-FITC/PerCP,抗 γ δ TCR-PE,抗 γ 9-FITC,抗 δ 2-FITC/PE,抗 CD80/86-FITC,抗HLADR-PE/PE-Cy5,抗 CD69-PE,抗 CD27-PE,抗CD45RA/RO-PE-Cy5(所有熒光標記單抗均購自BD公司);淋巴細胞分離液(LymphoprepTM,Axis-shield)。1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分選 密度梯度離心法分離全血獲取外周血單個核細胞(PBMC)和臍帶血單個核細胞(CBMC)。部分PBMC經(jīng)γ δ TCR磁珠分選獲取γ δT細胞(純度大于90%),用于細胞增殖實驗的效應(yīng)細胞;余陰選細胞經(jīng)CD4和CD8磁珠分選去除CD4+T細胞和CD8+T細胞后,用于增殖實驗的輔佐細胞。部分PBMC和全部CBMC用于流式分析細胞表型和細胞培養(yǎng)。

1.3.2 細胞增殖實驗 將磁珠分選得到的γ δT細胞用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1×106ml-1,加入 96孔培養(yǎng)板,每孔 100 μ l;含或不含 IL-2(20 U/ml)、不同濃度的 IPP(0.08 、0.8、3.2、8.0、20、80.0 μ g/ml)或 Mtb-Ag(20.0 μ g/ml)[9]的 RPMI1640培基每孔50 μ l;將輔佐細胞用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成4×105ml-1,每孔 50 μ l,37℃、5%CO2 飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)。6天后加入3[H]-TdR 1μ Ci/孔,繼續(xù)培養(yǎng)16小時后,收集細胞,β液閃計數(shù)儀測定3[H]-TdR摻入量,結(jié)果以每分脈沖數(shù)(cpm)表示。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 將PBMC和CBMC分別用含10%FBS、IL-2(5 U/ml)和最佳濃度IPP的 RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成1×106ml-1,加入24孔培養(yǎng)板,每孔1 ml,37℃、5%CO2飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.4 γ δ T細胞誘導(dǎo)前后的表型分析 流式細胞術(shù)分析γ δ T細胞在健康人外周血和新生兒臍帶血T細胞中的比例、Vγ 9Vδ 2 T細胞亞群在 γ δ T 細胞中的分布及其亞型;檢測IPP誘導(dǎo)后γ δ T細胞的比例,同時分析Vγ 9Vδ 2 T細胞的亞型和表型變化。流式細胞儀檢測結(jié)果使用BD CellQuest軟件進行分析。

圖1 外周血和臍帶血γ δT細胞數(shù)量及亞群的異質(zhì)性Fig.1 The heterogeneity of γ δT cells in the quantity and subgroups between peripheral blood and cord blood

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用Prism(Graph-Pad)軟件進行分析。用雙側(cè)配對 t檢驗對兩組數(shù)值進行比較;用方差分析處理組內(nèi)數(shù)據(jù);將P＜0.05視為有統(tǒng)計學差異并在圖中進行標注(*.0.01＜P＜0.05;**.0.001＜P＜0.01;***.P＜0.001)。

2 結(jié)果

2.1 外周血和臍帶血γ δT細胞數(shù)量及亞群的異質(zhì)性 外周血 γ δ T細胞比例明顯高于臍帶血 γ δT細胞的比例,前者為6.161±1.456,后者為1.644±0.307,兩者具有統(tǒng)計學差異(圖1A);外周血和臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細胞亞群比例差異顯著(17.98±6.07,91.39±6.67)且其各亞型分布格局不同(圖1B、C)。2.2 IPP誘導(dǎo)γ δ T細胞的擴增存在劑量依賴 微量濃度IL-2具有協(xié)同IPP對γ δT細胞的促增殖作用。IPP誘導(dǎo)γ δ T細胞增殖效能以2 μ g/ml協(xié)同微量IL-2(5 U/ml)作用最顯著。如圖2所示。

圖2 IPP誘導(dǎo)γ δT細胞擴增呈劑量依賴Fig.2 IPP-induced expansion of γ δT cells is dose-dependent

2.3 IPP對臍帶血γ δ T細胞的誘導(dǎo)作用 在 IPP作用下,外周血 γ δT細胞比例明顯增高,且大部分Vγ 9Vδ 2 T細胞被活化成效應(yīng)記憶型(CD27-CD45RA-);IPP同樣誘導(dǎo)臍帶血γ δT細胞擴增,但不同的是Vγ 9Vδ 2 T細胞雖趨向中央記憶型(CD27+CD45RA-)和效應(yīng)記憶型(CD27-CD45RA-)分化,但仍以幼稚型(CD27+CD45RA+)為主,見圖3。

2.4 IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細胞特征 被IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細胞的特征之一在于高表達HLA-DR和 B7分子(圖4)。而臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細胞表面HLA-DR和B7分子也有一定程度的表達。

圖3 IPP對γ δT細胞的誘導(dǎo)作用Fig.3 γ δT cells induced with IPP

圖4 IPP活化的外周血Vγ 9V δ 2 T細胞表型特征Fig.4 The phenotype characteristic of PB V γ 9Vδ 2 T cells activated by IPP

3 討論

人類γ δ T細胞根據(jù)其TCRγ、δ鏈的不同組合可分為多個亞群,由于其亞群的異質(zhì)性而呈現(xiàn)了不同的生物學特性[3,10]。最初人們對γ δ T細胞的認識只限于其在固有免疫中的作用,然而自上個世紀八、九十年代,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)γ δT細胞在適應(yīng)性免疫中同樣扮演著重要的角色。因此對于γ δ T細胞的定義,就有“第一道防線”,“調(diào)節(jié)細胞”或“先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁”等,但這些都只是描述了其復(fù)雜行為的某一層面[11]。事實上,在胸腺和外周組織中,γ δ T細胞的發(fā)育受其它免疫活性細胞的影響,形成了一個具有獨特生物學特征的淋巴細胞亞群系統(tǒng),對健康組織、免疫細胞,病原體持續(xù)感染的組織以及宿主對病原體的免疫應(yīng)答都有很多直接或間接的影響。近年來,γ δT細胞具有的專職性抗原遞呈細胞的特性已成為人們研究的熱點。Moser等研究了人扁桃體來源的γ δT細胞,發(fā)現(xiàn)其具有專職性抗原遞呈細胞的表型和功能[12,13];隨后國內(nèi)外科學家陸續(xù)在小鼠和牛的實驗中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象[14,15]。此外 ,γ δT細胞通過分泌 IL-17、IFN-γ等細胞因子在感染性疾病和腫瘤中的作用也再次受到關(guān)注[16-18]。目前發(fā)現(xiàn)γ δT細胞在感染免疫、自身免疫和腫瘤免疫中都發(fā)揮著重要的作用[19,20],可見γ δT細胞是一種“全能細胞”,與人類的很多疾病都有或多或少的聯(lián)系,有很大的研究空間和臨床價值。

由于γ δT細胞在外周血中數(shù)量很少,為我們深入研究其分化過程和生物學功能帶來一定困難,目前已有多種擴增外周血中γ δT細胞的方法[21,22],特別是何維教授的課題組成功建立了一例健康人γ δT細胞的克隆[23]。本課題組一直致力于應(yīng)用臍帶血為 γ δ T 細胞的來源,尤其是研究 γ δT 細胞的分化 。若能從新生兒臍帶血擴增出γ δ T細胞必將為我們提供豐富的細胞來源,為進一步研究γ δT細胞奠定實驗基礎(chǔ)。本文通過對外周血和臍帶血中γ δ T細胞的誘導(dǎo)活化擴增,分析兩者的差異及其不同階段的表型特征,以期確定發(fā)揮抗原遞呈作用的主要亞型以及此亞型的其它生物學功能,為探索其與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性打下基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果表明外周血和臍帶血γ δ T細胞在數(shù)量、亞群諸方面都有明顯的差異,且二者對IPP的反應(yīng)性不同。外周血γ δ T細胞被有效地活化成效應(yīng)記憶型的同時,高表達抗原遞呈相關(guān)的表面分子。由于臍帶血來源的γ δT細胞主要是幼稚型細胞,在體外培養(yǎng)過程中,仍需相關(guān)細胞因子(如:IL-7、IL-15等[24,25])的協(xié)同作用,才能完全呈現(xiàn)出其分化成熟為可用于理論研究和臨床實驗的效應(yīng)記憶型γ δ T細胞的潛能。

本文旨在報道我們對γ δ T細胞分化和表型分析的前期研究,為深入研究γ δ T細胞的功能,尤其是其抗原遞呈作用做一鋪墊,更為將γ δT細胞用于免疫調(diào)節(jié)和干預(yù)自身免疫病與腫瘤提供實驗依據(jù)。

真誠感謝蚌埠醫(yī)學院李柏青教授的指導(dǎo)和惠贈結(jié)核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)。

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