張慧敏 劉清池 潘 邢江濤 張玉娜 (石家莊平安醫(yī)院,石家莊 050021)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia,AA,簡稱再障)是一組由于物理、化學、生物因素或不明原因引起的骨髓造血功能衰竭的異質性疾病。第46屆美國血液學年會明確提出AA是自身免疫性疾病,機體免疫調節(jié)機制紊亂在AA發(fā)病中起重要作用,大量研究顯示細胞免疫功能紊亂與造血衰竭密切相關[1]。AA發(fā)病中免疫激活的同時伴有免疫耐受的打破[2]。CD200分子是一種新發(fā)現(xiàn)的具有免疫調節(jié)功能的分子,與CD200R相互作用能使IL-2、IFN-γ等1型細胞因子生成減少,IL-4、IL-10等2型細胞因子生成增多[3],由此來干預Th細胞的生成與分化,促進免疫耐受。本研究采用流式細胞術檢測了60例AA患者和30名健康人外周血T淋巴細胞亞群上CD200的表達率,用ELISA 法檢測了血清中 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的濃度,以探討CD200在AA發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 重型再障(SAA)30例、非重型再障(NSAA)30例,男28例,女32例,中位年齡 32.6歲(7～62歲);30名健康志愿者作為正常對照組(NC),男13例,女17例,中位年齡37歲(21～58歲)。

1.2 主要儀器及試劑 四色流式細胞儀及抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體為美國Beckman Coulte公司生產;抗CD200單抗購自美國Invitrogen公司;MK3型酶標儀及自動洗板機為芬蘭雷勃公司生產;ELISA試劑盒(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)購自上海西唐生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集 抽取靜脈血8 ml,其中5 ml用EDTA抗凝,檢測CD200表達率;3 ml收集血清,冷凍保存,待測相關細胞因子濃度。

1.3.2 CD200測定方法 用淋巴細胞分離液分離EDTA抗凝血樣本中單個核細胞(PBMC)。向順序編好號的試管中加入單克隆抗體各10 μ l,加入PBMC懸液100 μ l,室溫避光孵育20分鐘,溶血,加入PBS緩沖液,離心。應用四色流式細胞儀,以相應熒光標記的同型對照IgG1染色細胞為陰性對照,以CD3陽性細胞設門,測定各T細胞亞群CD200陽性比例。

1.3.3 細胞因子測定方法 采用雙抗體夾心法ABC-ELISA。用抗人 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 單抗包被于酶標板上,標準品與樣品中的細胞因子與單抗結合,加入生物素化的第一抗體工作液,辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合,加入底物工作液顯藍色,最后加入終止液,在450 nm處測OD值,求出標準曲線,計算出樣本含量。

2 結果

2.1 SAA 、NSAA 患者 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞上CD200的平均表達率均顯著低于正常對照組;而SAA組與NSAA組之間無顯著性差異,見表1。

表1 再障患者T淋巴細胞亞群上CD200的表達率(±s,%)Tab.1 Expression of CD200 on T lymphocytes from different group of AA patients and normal controls(±s,%)

表1 再障患者T淋巴細胞亞群上CD200的表達率(±s,%)Tab.1 Expression of CD200 on T lymphocytes from different group of AA patients and normal controls(±s,%)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with control.

Groups n CD200+/CD3+ CD200+/CD3+CD4+ CD200+/CD3+CD8+Control 30 30.164±1.984 24.505±1.816 22.623±1.523 SAA 30 21.137±2.1351) 15.995±1.9541) 16.726±1.6382)NSAA 30 22.118±2.8052) 16.555±2.5682) 16.745±2.1532)

表2 再障患者血清中IL-2、IFN-γ的濃度(±s,ml)Tab.2 Serum levels of IL-2, IFN-γ in different group of AA patients and normal controls( ±s,pg/)

表2 再障患者血清中IL-2、IFN-γ的濃度(±s,ml)Tab.2 Serum levels of IL-2, IFN-γ in different group of AA patients and normal controls( ±s,pg/)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with control;3)P＜0.01,compared with NSAA.

Groups n IL-2 IFN-γ Control 30 22.859±1.173 21.755±1.565 SAA 30 33.800±1.2631)2) 36.853±1.6841)2)NSAA 30 28.082±1.6593) 27.335±2.2133)

表3 再障患者血清中IL-4、IL10的濃度(±s,pg/ml)Tab.3 Serum levels of IL-4,IL10 in different group of AA patients and normal controls(±s,pg/ml)

表3 再障患者血清中IL-4、IL10的濃度(±s,pg/ml)Tab.3 Serum levels of IL-4,IL10 in different group of AA patients and normal controls(±s,pg/ml)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with NSAA.

Groups n IL-4 IL-10 Control 30 21.895±0.587 24.814±0.791 SAA 30 14.174±0.6321)2) 17.911±0.8521)2)NSAA 30 16.545±0.8311) 20.827±1.1191)

表4 再障患者CD3+T 淋巴細胞上CD200表達率與血清中相關細胞因子濃度的相關性分析(r 值)Tab.4 The correlation between the expression rate of CD200 on CD3+T lymphocytes and the serum levels of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10(rvalue)

2.2 SAA、NSAA患者血清中IL-2、IFN-γ的平均濃度均顯著高于正常對照組,且SAA組顯著高于NSAA組;IL-4、IL-10的平均濃度顯著低于正常對照組,且SAA組顯著低于NSAA組。見表2、3。

2.3 AA患者CD3+T淋巴細胞上CD200表達率與血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平均呈負相關。見表 4。

3 討論

CD200分子是在2000年人白細胞分化抗原研討會上被命名的I型膜糖蛋白,廣泛表達在人類胸腺細胞、B淋巴細胞、激活的T淋巴細胞、濾泡狀樹突細胞、內皮細胞等。CD200與CD200R相互作用,可以提供負調控信號,減低髓系細胞(單核細胞和巨噬細胞)活性,誘導Th1向Th2“克隆轉換”,引起免疫低應答的產生,并可以下調動物對自身免疫病的敏感性。敲除CD200基因的鼠體內髓系細胞的數(shù)量和活性都高于正常鼠,并且對自身免疫病的易感性增加。調節(jié)性T細胞(Treg)具有低反應性與免疫抑制性兩大功能,有研究結果提示誘生Treg是CD200誘導免疫耐受的機制之一[4]。

再障的主要發(fā)病機制為T細胞介導的針對骨髓造血細胞產生的自身免疫反應[5]。涂梅峰等[6]發(fā)現(xiàn):SAA患者的Treg細胞數(shù)量減少,可能導致患者免疫耐受被打破。我們檢測到SAA和NSAA患者T淋巴細胞上CD200的表達率均顯著降低,提示作為一種負調控信號的CD200,可以下調髓系細胞活性,由于受某種原因或不明因素的影響,在再障患者體內表達明顯減少,而當機體缺乏CD200時,骨髓中的髓系細胞活性增加、Th1型細胞因子增加、誘生調節(jié)性T細胞的能力減弱,使免疫耐受打破,機體對AA的易感性增加。SAA與NSAA無顯著性差異,提示AA的發(fā)病有多因素參與,CD200表達異常只是參與AA發(fā)病的因素之一。

再障是Th1細胞功能亢進性疾病,Th1/Th2比例失衡,Dubey等[7]分別對正常對照和AA患者的骨髓及T淋巴細胞漿內TNF-α、IFN-γ研究發(fā)現(xiàn),AA患者骨髓內兩種細胞因子含明顯高于正常對照組。國內學者[8]發(fā)現(xiàn)SAA患者血清sIL-2R水平明顯高于正常對照組。我們的檢測結果與國內外文獻報道一致,說明AA的發(fā)病不僅與T細胞功能紊亂及其分泌的Th1型細胞因子增高有關,還與Th2型細胞減少及Th2型細胞因子相對不足有關。

相關性分析提示:由于負調控因子CD200減少,不能有效抑制T細胞介導的過度免疫應答,AA患者體內IL-2、IFN-γ等Th1型細胞因子增多,二者呈負相關。另外,CD200表達率與Th2型細胞因子水平亦成負相關,對此,我們認為,雖然由于本組AA患者T淋巴細胞上CD200明顯減少,所誘導的T淋巴細胞分泌的Th2型細胞因子會相應明顯減少,但機體可能通過其它途徑試圖上調Th2型細胞因子的分泌,提升Th2型細胞因子的血清水平,努力實現(xiàn)對自身抗原的免疫耐受,進一步說明AA發(fā)病機制的復雜性。

1 Nakao S,Feng X,Sugimori C.Immune pathophysiology of aplastic anemia[J].Int J Hematol,2005;82(3):196-200.

2 袁 燁,邵宗鴻.獲得性再生障礙性貧血發(fā)病機制的研究進展[J].國外醫(yī)學·輸血及血液學分冊,2006;29(3):200-203.

3 Diao J,Gorczyski RM,Cattral M.Regulatory role of CD200 on dendritic cells[J].FASEB J,2002;16(5):226-267

4 Gorczyski RM,Lee L,Boudakav I et al.Augmented induction of CD4+CD25+Treg using monoclonal antibodies to CD200R[J].Transplantation,2005;79:488-491.

5 Nakao S,Feng X,Sugimori C.Immune pathophysiology of aplastic[J].Int J Hematol,2005;82(3):196-200.

6 涂梅峰,邵宗鴻,劉 鴻 et al.重型再生障礙性貧血患者Th3細胞、調節(jié)T細胞數(shù)量和轉化生長因子βl的水平[J].中華血液學雜志,2006;27(11):753-756

7 Dubey S,Shukla P,Nityanand S et al.Expressionof interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha in bone marrow T cells and their levels in bone marrow plasma in patients with aplastic anemia[J].Ann Hematol,2005;84(9):572-577.

8 程 鵬,彭志剛,寧自覺.再生障礙性貧血患者造血祖細胞及免疫機制的研究[J].西部醫(yī)學,2007;19(5):778-780.