隨著醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)映異構(gòu)體在藥理、毒理和臨床療效等方面存在著較大的差異，因此藥物對(duì)映體的拆分工作具有重要意義?？藗愄亓_(Clenbuterol)是β2腎上腺受體激動(dòng)劑，主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣[1]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 克倫特羅的結(jié)構(gòu)式

克倫特羅分子中含有一個(gè)手性中心，目前臨床上應(yīng)用的克倫特羅均為外消旋體，但研究表明臨床上有效的一般為其(-)-異構(gòu)體，而(+)-異構(gòu)體則對(duì)療效沒有貢獻(xiàn)[2]。目前，關(guān)于克倫特羅單一對(duì)映體的藥理活性、藥代動(dòng)力學(xué)研究罕見文獻(xiàn)報(bào)道，建立克倫特羅手性分離方法對(duì)深入研究其對(duì)映體的藥效、藥理作用具有重要意義。因此，有必要對(duì)克倫特羅對(duì)映體進(jìn)行拆分研究，建立快速、靈敏、分離性能好的測(cè)定方法。

目前，藥物的拆分方法主要有高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。宋雅茹等[3]將酰胺型手性固定相用于高效液相色譜拆分克倫特羅對(duì)映體；唐琴等[4]用Whelk-O1手性固定相成功拆分了克倫特羅對(duì)映體；黃可龍等[5]用毛細(xì)管電泳法以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性添加劑拆分了克倫特羅。但至今還沒有關(guān)于利用替考拉寧手性固定相對(duì)克倫特羅進(jìn)行手性拆分的報(bào)道。替考拉寧手性固定相的結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 替考拉寧手性固定相結(jié)構(gòu)式

作者首次采用替考拉寧手性固定相對(duì)克倫特羅對(duì)映體進(jìn)行了分離，并從結(jié)構(gòu)上探討了手性分離的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

鹽酸克倫特羅，青島雙鯨藥業(yè)；甲醇(MeOH)、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃，色譜純，天津市康科德科技有限公司；冰醋酸(HAc)、三乙胺(TEA)、硝酸銨，特級(jí)純，天津市博迪化工有限公司。

Jasco UV-980型高壓輸液泵、Jasco UV-975型檢測(cè)器，Jasco 日本分光公司；IC 2001 plus 型柱溫箱；Anastar 色譜工作站，U6K型進(jìn)樣閥(20 L定量環(huán))；DT-100A型分析天平；PHS-25型pH計(jì)；DL-180型超聲波清洗機(jī)。

1.2 色譜條件及分離影響

藥物對(duì)照品用甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg·mL-1的供試液。

色譜柱:Chirobiotic T (150 mm×4.6 mm ,5 μm) (Advanced Separation Technologies Inc．，美國(guó));流速:1.0 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm；進(jìn)樣量:2 μL。

考察分離模式、流動(dòng)相組成、柱溫等因素對(duì)克倫特羅對(duì)映體分離的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離模式的選擇

替考拉寧手性固定相有正相、反相和新極性有機(jī)相三種分離模式。

在正相模式下，考察了兩種流動(dòng)相系統(tǒng):正己烷/乙醇和正己烷/異丙醇，并通過改變流動(dòng)相組成以實(shí)現(xiàn)手性分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此模式下，克倫特羅對(duì)映體在替考拉寧手性固定相上不能實(shí)現(xiàn)分離。

在反相模式下，首先采用廠家建議的0.1%TEA(pH值4.1)-20%甲醇為流動(dòng)相，考察了克倫特羅保留行為和選擇性受有機(jī)改性劑的性質(zhì)和濃度、緩沖溶液的性質(zhì)、濃度和pH值的影響，但通過優(yōu)化這些分離條件，克倫特羅對(duì)映體在替考拉寧手性固定相上均不能實(shí)現(xiàn)分離。

在新極性有機(jī)相模式下，克倫特羅對(duì)映體可獲得分離，因此，選擇分離模式為新極性有機(jī)相。

2.2 緩沖溶液的選擇

在新極性有機(jī)相模式下，考察了醋酸銨、硝酸銨和1%醋酸-三乙胺緩沖系統(tǒng)對(duì)分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克倫特羅在1%醋酸-三乙胺緩沖系統(tǒng)中可以實(shí)現(xiàn)手性分離。

2.3 流動(dòng)相組成的確定

以1%醋酸-三乙胺為緩沖系統(tǒng)，以甲醇-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)作為流動(dòng)相，考察了冰醋酸和三乙胺的濃度和比例對(duì)分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在替考拉寧手性固定相上，當(dāng)流動(dòng)相只含冰醋酸時(shí)，克倫特羅只能檢測(cè)到一個(gè)變形的色譜峰，不能實(shí)現(xiàn)手性分離；在只含三乙胺的流動(dòng)相中，克倫特羅對(duì)映體可實(shí)現(xiàn)一定的分離，但峰形不佳；在三乙胺存在的前提下，冰醋酸的加入可以改善色譜峰的峰形和對(duì)稱性，兩者比例為1∶1時(shí)克倫特羅對(duì)映體的分離效果最佳。因此，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.1∶0.1,體積比)為起始流動(dòng)相，考察了緩沖溶液成分(冰醋酸/三乙胺)的濃度對(duì)克倫特羅在替考拉寧手性固定相上保留行為和對(duì)映體選擇性的影響，結(jié)果見表1。

表1 新極性有機(jī)相模式下流動(dòng)相組成對(duì)克倫特羅對(duì)映體在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響

注：流速為 1.0 mL·min-1， 柱溫為20℃

由表1可知，隨著冰醋酸/三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%，克倫特羅的保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，分離效果顯著提高；但當(dāng)冰醋酸/三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時(shí)，克倫特羅的保留時(shí)間過長(zhǎng)，色譜峰展寬，分離效果下降。當(dāng)甲醇-冰醋酸-三乙胺的體積比為100∶0.01∶0.01時(shí)，克倫特羅對(duì)映體可實(shí)現(xiàn)基線分離，最大分離度達(dá)3.75，分離色譜圖見圖3。因此，確定最佳流動(dòng)相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，體積比)。

注：流動(dòng)相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,體積比)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為20℃

2.4 柱溫的選擇

柱溫對(duì)分離度和保留時(shí)間有著重要的影響。以甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,體積比)為流動(dòng)相，考察了克倫特羅對(duì)映體在10℃、20℃、30℃和40℃下的分離情況，結(jié)果見表2。

表2 溫度對(duì)克倫特羅在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響

由表2可知，隨著溫度的升高，克倫特羅的保留時(shí)間和對(duì)映體選擇性均相應(yīng)降低，權(quán)衡分離度、保留時(shí)間及實(shí)際操作性，選取最佳分離溫度為20℃。

2.5 分離機(jī)制的探討

替考拉寧分子中含有多種官能團(tuán)和不對(duì)稱中心，可與被分析物質(zhì)產(chǎn)生多種作用，如疏水作用、包合作用、偶極-偶極作用、π-π誘導(dǎo)作用、氫鍵作用、空間位阻作用及范德華相互作用?？藗愄亓_的結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)、羥基、鹵素和氨基基團(tuán)，可以與手性選擇劑上相應(yīng)的官能團(tuán)發(fā)生相互作用從而實(shí)現(xiàn)手性分離。新極性有機(jī)相模式可以提升這些相互作用，因此在此模式下，克倫特羅對(duì)映體達(dá)到了在正相和反相模式下不能實(shí)現(xiàn)的分離效果。而在新極性有機(jī)相模式下，必須有三乙胺存在于流動(dòng)相中才可實(shí)現(xiàn)克倫特羅對(duì)映體的分離，當(dāng)流動(dòng)相中同時(shí)含有三乙胺和冰醋酸時(shí)，分離效果最佳，這說明離子作用是此模式下對(duì)映體分離的最主要作用機(jī)制，而克倫特羅的手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果。

3 結(jié)論

采用替考拉寧手性固定相成功實(shí)現(xiàn)了克倫特羅對(duì)映體的直接分離，確定最佳色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，體積比)，流速1.0 mL·min-1，柱溫20℃。在此條件下，克倫特羅對(duì)映體可實(shí)現(xiàn)基線分離，最大分離度達(dá)3.75。該方法簡(jiǎn)單，操作方便，可以用于克倫特羅對(duì)映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

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