侯睿哲,彭云香,毛靜濤,侯治富*

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學院,吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033;3.北京龍邁達科技有限公司,北京 100176)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是全世界范圍內惡性腫瘤死亡的主要原因之一,早期診斷和早期治療對胃癌預后具有很大影響。其生物標志一直是人們關注和研究的熱點[1]。有文獻表明,CK19可以預測早期胃癌[2]。我們通過組織芯片技術,采用免疫組織化學方法,研究 EpCAM和CK19[3-4]表達的臨床意義,探討其在早期胃癌的診斷與預后評價中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

從北京龍邁達科技有限公司的標本組織庫中選取臨床診斷,術后病理診斷明確的良性病變7例、胃癌31例為實驗組,所有病例術前均未接受化療或放療。隨機取正常胃黏膜16例為正常對照組。

1.2 試劑

即用型鼠抗人細胞角蛋白19(CK19)單克隆抗體、通用型SP試劑盒、濃縮型DAB試劑盒等由北京中杉金橋生物技術有限公司生產;過碘酸、伊紅、蘇木素染液、中性樹膠卦片劑等由本實驗室提供。即用型鼠抗人EpCAM單克隆抗體(ABIN 180642)購于Antibodies-online。

1.3 方法

1.3.1 石蠟包埋標本的準備 福爾馬林常規(guī)固定24 h,系列酒精脫水,石蠟包埋,獲得石蠟包埋組織。

1.3.2 常規(guī)切片、HE染色,鏡下進行再次診斷,并定位;對于有異議的病例去除或再行免疫組化診斷。

1.3.3 組織芯片制作 選取準備的組織標本,選用2 mm芯片針,以組織芯片儀,在組織標本蠟塊上再行取材,然后,按照預先做好的組織芯片設計,將所需病例數(shù)目,在模板蠟塊中進行組織列陣,完成組織芯片一張為7×8的組織蠟塊的制作。

1.3.4 將組織芯片蠟塊進行連續(xù)切片,厚度是4 μ m,40℃裱片(玻片經過0.1%多聚賴氨酸防脫片處理),56℃烤片3 h后移到37℃恒溫箱中過夜,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 免疫組化染色及結果判定 ①脫蠟:組織芯片之切片置于二甲苯中浸泡20 min,換新鮮二甲苯重復一次。②再水化:將脫臘后的組織切片于100%乙醇中浸泡5 min×2次,95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各浸泡5 min。③抗原修復:抗原修復液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,將抗原修復液微波高火加熱至沸騰,將切片放入,再用微波高火加熱5 min,補加蒸餾水恢復體積后再用微波高火加熱5分鐘,自然冷卻至室溫。④去除內源性過氧化物酶:新鮮配置3%H2O2滴片,室溫下避光孵育10 min;PBS洗5 min。⑤封閉:用10%正常羊血清,室溫封閉10min。⑥一抗反應:滴片,分別加1∶100抗人上皮細胞角蛋白19(CK19)單克隆抗體及抗人上皮細胞粘附分子(EpCAM)單克隆抗體;10%正常羊血清作為實驗陰性對照(以PBS稀釋),4℃過夜反應;PBS洗5 min,共3次,不時晃動。⑦二抗反應和顯色:按照Dakocytomation Envision+TM System HRP試劑盒的說明書進行。⑧最后蘇木精復染細胞核,中性樹膠封片后,光學顯微鏡下觀察并記錄結果,比較兩種抗體對上皮來源的腫瘤細胞的特異性染色情況。

結果判定:CK19和EpCAM的表達部位分別在細胞胞漿和細胞胞膜,有棕黃色顆粒沉著。400倍光鏡至少觀察5個視野,陽性細胞＜5%為陰性、5%-25%為+、26%-50%為++、＞51%為+++。每批染色均設已知陽性對照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 應用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件,實驗結果進行 χ2檢驗和真實性分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CK19和EpCAM表達分析

用免疫組化方法,對16例正常組織、7例良性病變和31例胃癌中CK19和EpCAM的表達檢測結果表明,良性病變組織、胃癌組織中CK19和EpCAM的表達均顯著高于正常組織對照組。經spearman等級相關卡方檢驗P＜0.05,如表1所示。

表1 正常、良性病變和癌組織中 CK19、EpCAM的表達

2.2 對CK19和EpC AM在胃癌診斷試驗中的評價

以胃癌組織的術后病理診斷為金標準分別做CK19、EpCAM 、串聯(lián)實驗(CK19 陽性 、EpCAM 陽性為陽性,其余均為陰性)和并聯(lián)實驗(CK19陰性、Ep-CAM陰性為陰性,其余均為陽性)在胃癌診斷試驗中的真實性評價,結果如表2所示。

表2 CK19、EpCAM及其聯(lián)合實驗在胃癌診斷實驗中的真實性評價

由此可知,在胃癌的診斷實驗中靈敏度最高的為CK19和EpCAM的并聯(lián)實驗,特異度最高的是Ep-CAM實驗,但在排除患病率的影響時EpCAM實驗的診斷價值更高,且它是符合率和約登指數(shù)最高的診斷實驗,所以從胃癌的循證診斷真實性評價方面來看EpCAM實驗是最好的。

3 討論

腫瘤標志物(tumor markers,TM)的檢測與應用倍受人們關注,在早期診斷和早期治療中起著重要作用。國內目前把腫瘤標志物C12檢測系統(tǒng)廣泛應用于臨床,在胃癌的診斷中,貢獻率最高的是CA19-9(20.51%)、CA242(19.87%)、CEA(17.31%)等[3],也有學者提出CK19檢測有一定價值[4,5],但仍不理想。本實驗試圖探討CK19和EpCAM對胃癌早期診斷的意義。結果表明,良性病變組織、胃癌組織中CK19和EpCAM的表達均顯著高于正常組織對照組,經spearman等級相關卡方檢驗P＜0.05。提示對CK19和EpCAM的表達的監(jiān)測,可以幫助早期診斷。我們進一步通過監(jiān)測方法的真實性分析顯示,在胃癌的診斷實驗中可以用靈敏度比較高的CK19和EpCAM的并聯(lián)實驗來做初篩實驗,然后以特異度比較高的EpCAM染色結果進行第二次初篩,有利于降低胃癌的漏診和誤診率。經過診斷試驗的正確性和精確性檢驗,本研究的CK19和EpCAM可以作為一種新的檢測指標。同時證實了組織芯片技術的高通量、大樣本、本底一致等優(yōu)點,可以在臨床推廣使用。

[1]Lordick FJ,ger D.Current Status and Future of Chemotherapy and Biochemotherapy in Gastroesophageal Cancers[J].Gastrointest Cancer Res,2008,2(4):187.

[2]Kim MA,Lee HS,Yang HK et al.Cytokeratin expression profile in gastric carcinomas[J].Human pathology,2004,35(5):576-581.

[3]楊雪琴,陳 創(chuàng),候晉軒,等.多腫瘤標志物C12檢測系統(tǒng)在胃癌診斷中的價值分析[J].中國腫瘤臨床,2008,35(4):184.

[4]許德國,王濰博.胃癌患者腹腔灌洗液CK19mRNA、CEAmRNA的檢測及其臨床意義[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2008,46(6):600.

[5]岳 欣,馬 杰,王家倉.逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測胃癌患者外周血細胞角蛋白19表達[J].中國綜合臨床,2005,21(1):68.