王曉華，單鐵英，侯永超，楊書(shū)良

(1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院 a生物學(xué)教研組；b人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研組；c病理學(xué)教研室，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

以免疫治療為代表的腫瘤生物治療是重要的腫瘤輔助治療方法[1]。在腫瘤生物治療中應(yīng)用增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞活性的物質(zhì)，是提高療效的有效途徑。研究表明許多中藥或其有效成分具有多方面的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠增強(qiáng)免疫活性細(xì)胞的功能[2]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)枸杞多糖可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的能力從而產(chǎn)生抗腫瘤作用方面的報(bào)道很多，但是其具體的機(jī)制尚不明確，本研究觀察了枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides，LBPs)在樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及T細(xì)胞的激活、增殖和殺瘤過(guò)程中的作用。為進(jìn)一步研究LBPs調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮人外周血，購(gòu)自北京市血庫(kù)。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠。rhGM-CSF、rhIL-2和rhIL-4，購(gòu)自德國(guó)R&D公司。尼龍毛購(gòu)自FENWAL USA。鼠抗人MHC-Ⅱ、CD86、CD83，即用型二步法生物素檢測(cè)試劑盒(PV9000)、FITC標(biāo)記的第II抗體工作液購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。枸杞多糖購(gòu)自美國(guó)泛華公司。

1.2 方法

1.2.1 未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(Immature Dendritic Cell，imDC)的培養(yǎng)：取正常人新鮮外周血200ml，以淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并培養(yǎng)2 h，取貼壁細(xì)胞即單核細(xì)胞，加入 10%胎牛血清、rhGMCSF1000 U/m l、rhIL-4 500 U/m l繼續(xù)培養(yǎng) 7天即為imDC。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞全抗原致敏imDC并培養(yǎng)為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(Mature Dendritic Cell，mDC)：常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Bel-7402，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并反復(fù)凍融(-80℃/室溫)4次作為腫瘤細(xì)胞全抗原。將imDC調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)細(xì)胞/m l，加入腫瘤細(xì)胞全抗原0.2m l培養(yǎng)2天，即腫瘤細(xì)胞全抗原致敏的imDC。分為兩組：實(shí)驗(yàn)組：加入終濃度100 μg/m lLBPs；對(duì)照組：加入等量的 RPMI-1640；兩組分別同時(shí)作用48h后。觀察DC的形態(tài)變化及其表面標(biāo)志的表達(dá)。

1.2.3 T細(xì)胞的獲得：按上述獲得單核細(xì)胞的方法，收集非貼壁細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞，將3×107/m l的淋巴細(xì)胞注入尼龍毛柱，靜置1 h。用培養(yǎng)液洗柱，洗下的即為T細(xì)胞，加入rhIL-2 500 U/m l培養(yǎng)待用。1.2.4 T細(xì)胞的激活和增殖：懸浮上述T細(xì)胞為2×105個(gè)/100μl，放入96孔板，作為反應(yīng)細(xì)胞。mDCs作為刺激細(xì)胞。調(diào)整mDC濃度2×103個(gè)/孔、1×104個(gè)/孔、2×104個(gè)/孔分別與T細(xì)胞混合，分兩組 ：實(shí)驗(yàn)組 ：加入終濃度 100 μg/m lLBPs；對(duì)照組 ：加入等量的RPMI-1640；用MTT法測(cè)各孔的OD值。

增值指數(shù)為：實(shí)驗(yàn)組OD值-反應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值-刺激細(xì)胞對(duì)照組OD值/反應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值。

1.2.5 效應(yīng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞 將按上述方法獲得的兩組T細(xì)胞(T細(xì)胞+DC+LBPs、T 細(xì)胞+DC+

2.3 T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞 通過(guò)MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活力的影響，來(lái)表明腫瘤細(xì)胞的殺傷情況：在培養(yǎng)液中有LBPs存在時(shí)效應(yīng)T細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞能力增強(qiáng)，而對(duì)MG-63細(xì)胞不能有效地殺傷(P＜0.05)。未經(jīng)mDC刺激的T細(xì)胞作為對(duì)照，由于缺乏mDC的抗原呈遞和刺激作用，T細(xì)胞不具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力(表3)。RPMI-1640)，新鮮分離的T細(xì)胞作為對(duì)照。三組作為效應(yīng)細(xì)胞置96孔板中，分別以人肝癌細(xì)胞Bel-7402和人骨肉瘤細(xì)胞MG-63作為陽(yáng)性和陰性靶細(xì)胞，效靶比為30：1。用MTT法測(cè)各孔的OD值。

T細(xì)胞殺傷活性：靶細(xì)胞對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，可見(jiàn)細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓形變?yōu)槎狐c(diǎn)狀、蝌蚪狀、長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，并向四周伸出不規(guī)則狀的突起。

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)：imDC細(xì)胞表面MHC-Ⅱweak+、CD86weak+、CD83weak+。經(jīng) LBPs誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后的DC的表面標(biāo)志及蛋白表達(dá)發(fā)生變化：MHCII+、CD86+、CD83+，陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。而經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)的mDC分子表達(dá)與培養(yǎng)前無(wú)明顯變化。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的DC的分子表達(dá)圖像分析(表1)。

2.2 T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)MTT法檢測(cè)LBPs對(duì)T細(xì)胞活力的影響，來(lái)表明T細(xì)胞的增殖情況：培養(yǎng)液中LBPs有時(shí)DC激發(fā)T細(xì)胞增殖的能力進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05)(表2)。且在此濃度范圍內(nèi)隨著DCs濃度的增加T細(xì)胞的增殖率也增加。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)2天后的樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)的圖像分析結(jié)果(ˉx±s)

表2 T細(xì)胞增殖率(ˉx±s，n=10)

表3 效應(yīng)T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)(ˉx±s，n=10)

3 討論

枸杞多糖是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成，具有廣譜防癌抗癌和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[6]。

DC是一種重要的專職抗原提呈細(xì)胞，對(duì)啟動(dòng)輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答具有重要作[7-9]。imDC俘獲和處理外源性抗原后為mDC，通過(guò)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子來(lái)激活T細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)證明，DC的成熟狀態(tài)與其功能有關(guān)：imDC有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，同時(shí)低表達(dá)MHC-II、CD86、CD83。mDC攝取抗原功能下降，但是MHCII、CD86、CD83分子高表達(dá)。這些分子正是與DC抗原提呈作用密切相關(guān)的分子，也是與DC對(duì)T細(xì)胞的激活作用密切相關(guān)的分子。我們發(fā)現(xiàn)DC經(jīng)過(guò)LBPs刺激作用后，MHC-II、CD86、CD83的表達(dá)增高，同時(shí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)也證實(shí)，經(jīng)LBPs培養(yǎng)后DC激活T細(xì)胞能力及T細(xì)胞增殖能力都增強(qiáng)。這些都說(shuō)明LBPs誘導(dǎo)DC成熟，同時(shí)刺激T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。

經(jīng)肝癌細(xì)胞抗原致敏imDC并培養(yǎng)為mDC激活的T細(xì)胞能特異性的殺傷肝癌細(xì)胞，而培養(yǎng)液中有LBPs存在時(shí)效應(yīng)T細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞的能力進(jìn)一步增強(qiáng)。對(duì)MG-63細(xì)胞因?yàn)椴荒苡行У刈R(shí)別所以不能殺傷。

有研究表明，適量的枸杞多糖能增加T細(xì)胞IL-2受體的表達(dá)量，枸杞多糖對(duì)T細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用可能通過(guò)增加IL-2R的表達(dá)量協(xié)同IL-2對(duì)T細(xì)胞的刺激作用，提示枸杞多糖對(duì)T細(xì)胞活性的增強(qiáng)效應(yīng)部分與促進(jìn)IL-2R的表達(dá)有關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對(duì)免疫活性細(xì)胞無(wú)直接刺激作用，DC表面存在多糖受體，枸杞多糖可與DC表面存在的多糖受體結(jié)合[11]，啟動(dòng)和活化DC使其分泌細(xì)胞活性因子，活化的DC及其釋放的活性因子的間接作用促進(jìn)T細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的功能；同時(shí)，T細(xì)胞被IL-2等第一信號(hào)活化后也可表達(dá)多糖受體，與多糖類物質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。這些都表明在培養(yǎng)液中有LBPs存在時(shí)效應(yīng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力增強(qiáng)。

本研究只是通過(guò)上述幾種實(shí)驗(yàn)證明枸杞多糖能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和殺傷腫瘤的活性。但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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