王曉華，單鐵英，侯永超，楊書良

(1.河北工程大學醫(yī)學院 a生物學教研組；b人體解剖學與組織胚胎學教研組；c病理學教研室，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

以免疫治療為代表的腫瘤生物治療是重要的腫瘤輔助治療方法[1]。在腫瘤生物治療中應用增強抗腫瘤細胞活性的物質(zhì)，是提高療效的有效途徑。研究表明許多中藥或其有效成分具有多方面的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠增強免疫活性細胞的功能[2]。目前國內(nèi)有關(guān)枸杞多糖可增強免疫系統(tǒng)的能力從而產(chǎn)生抗腫瘤作用方面的報道很多，但是其具體的機制尚不明確，本研究觀察了枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides，LBPs)在樹突狀細胞成熟及T細胞的激活、增殖和殺瘤過程中的作用。為進一步研究LBPs調(diào)節(jié)特異性免疫應答的機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮人外周血，購自北京市血庫。淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。rhGM-CSF、rhIL-2和rhIL-4，購自德國R&D公司。尼龍毛購自FENWAL USA。鼠抗人MHC-Ⅱ、CD86、CD83，即用型二步法生物素檢測試劑盒(PV9000)、FITC標記的第II抗體工作液購自北京中山生物技術(shù)有限公司。枸杞多糖購自美國泛華公司。

1.2 方法

1.2.1 未成熟樹突狀細胞(Immature Dendritic Cell，imDC)的培養(yǎng)：取正常人新鮮外周血200ml，以淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞并培養(yǎng)2 h，取貼壁細胞即單核細胞，加入 10%胎牛血清、rhGMCSF1000 U/m l、rhIL-4 500 U/m l繼續(xù)培養(yǎng) 7天即為imDC。

1.2.2 腫瘤細胞全抗原致敏imDC并培養(yǎng)為成熟樹突狀細胞(Mature Dendritic Cell，mDC)：常規(guī)培養(yǎng)肝癌細胞株Bel-7402，收集處于對數(shù)生長期的細胞并反復凍融(-80℃/室溫)4次作為腫瘤細胞全抗原。將imDC調(diào)整細胞濃度至1×106個細胞/m l，加入腫瘤細胞全抗原0.2m l培養(yǎng)2天，即腫瘤細胞全抗原致敏的imDC。分為兩組：實驗組：加入終濃度100 μg/m lLBPs；對照組：加入等量的 RPMI-1640；兩組分別同時作用48h后。觀察DC的形態(tài)變化及其表面標志的表達。

1.2.3 T細胞的獲得：按上述獲得單核細胞的方法，收集非貼壁細胞即為淋巴細胞，將3×107/m l的淋巴細胞注入尼龍毛柱，靜置1 h。用培養(yǎng)液洗柱，洗下的即為T細胞，加入rhIL-2 500 U/m l培養(yǎng)待用。1.2.4 T細胞的激活和增殖：懸浮上述T細胞為2×105個/100μl，放入96孔板，作為反應細胞。mDCs作為刺激細胞。調(diào)整mDC濃度2×103個/孔、1×104個/孔、2×104個/孔分別與T細胞混合，分兩組 ：實驗組 ：加入終濃度 100 μg/m lLBPs；對照組 ：加入等量的RPMI-1640；用MTT法測各孔的OD值。

增值指數(shù)為：實驗組OD值-反應細胞對照組OD值-刺激細胞對照組OD值/反應細胞對照組OD值。

1.2.5 效應T細胞殺傷腫瘤細胞 將按上述方法獲得的兩組T細胞(T細胞+DC+LBPs、T 細胞+DC+

2.3 T細胞殺傷腫瘤細胞 通過MTT法檢測腫瘤細胞活力的影響，來表明腫瘤細胞的殺傷情況：在培養(yǎng)液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷肝癌細胞能力增強，而對MG-63細胞不能有效地殺傷(P＜0.05)。未經(jīng)mDC刺激的T細胞作為對照，由于缺乏mDC的抗原呈遞和刺激作用，T細胞不具有特異性殺傷腫瘤細胞的能力(表3)。RPMI-1640)，新鮮分離的T細胞作為對照。三組作為效應細胞置96孔板中，分別以人肝癌細胞Bel-7402和人骨肉瘤細胞MG-63作為陽性和陰性靶細胞，效靶比為30：1。用MTT法測各孔的OD值。

T細胞殺傷活性：靶細胞對照組OD值-實驗組OD值-效應細胞OD值/靶細胞對照組OD值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0軟件進行處理，結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 單核細胞在培養(yǎng)過程中，可見細胞體積逐漸增大，細胞形態(tài)逐漸由圓形變?yōu)槎狐c狀、蝌蚪狀、長梭形或不規(guī)則形，并向四周伸出不規(guī)則狀的突起。

免疫細胞化學檢測：imDC細胞表面MHC-Ⅱweak+、CD86weak+、CD83weak+。經(jīng) LBPs誘導培養(yǎng)2 d后的DC的表面標志及蛋白表達發(fā)生變化：MHCII+、CD86+、CD83+，陰性對照無陽性信號。而經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)的mDC分子表達與培養(yǎng)前無明顯變化。對照組與實驗組培養(yǎng)的DC的分子表達圖像分析(表1)。

2.2 T細胞增殖實驗結(jié)果 通過MTT法檢測LBPs對T細胞活力的影響，來表明T細胞的增殖情況：培養(yǎng)液中LBPs有時DC激發(fā)T細胞增殖的能力進一步增強(P＜0.05)(表2)。且在此濃度范圍內(nèi)隨著DCs濃度的增加T細胞的增殖率也增加。

表1 實驗組和對照組培養(yǎng)2天后的樹突狀細胞表面分子表達的圖像分析結(jié)果(ˉx±s)

表2 T細胞增殖率(ˉx±s，n=10)

表3 效應T細胞殺傷實驗(ˉx±s，n=10)

3 討論

枸杞多糖是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成，具有廣譜防癌抗癌和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[6]。

DC是一種重要的專職抗原提呈細胞，對啟動輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的免疫應答具有重要作[7-9]。imDC俘獲和處理外源性抗原后為mDC，通過主要組織相容性復合物(MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子來激活T細胞，啟動特異性免疫應答。實驗證明，DC的成熟狀態(tài)與其功能有關(guān)：imDC有較強的抗原攝取和加工能力，同時低表達MHC-II、CD86、CD83。mDC攝取抗原功能下降，但是MHCII、CD86、CD83分子高表達。這些分子正是與DC抗原提呈作用密切相關(guān)的分子，也是與DC對T細胞的激活作用密切相關(guān)的分子。我們發(fā)現(xiàn)DC經(jīng)過LBPs刺激作用后，MHC-II、CD86、CD83的表達增高，同時混合淋巴細胞反應也證實，經(jīng)LBPs培養(yǎng)后DC激活T細胞能力及T細胞增殖能力都增強。這些都說明LBPs誘導DC成熟，同時刺激T細胞增殖能力增強。

經(jīng)肝癌細胞抗原致敏imDC并培養(yǎng)為mDC激活的T細胞能特異性的殺傷肝癌細胞，而培養(yǎng)液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷肝癌細胞的能力進一步增強。對MG-63細胞因為不能有效地識別所以不能殺傷。

有研究表明，適量的枸杞多糖能增加T細胞IL-2受體的表達量，枸杞多糖對T細胞活性的增強作用可能通過增加IL-2R的表達量協(xié)同IL-2對T細胞的刺激作用，提示枸杞多糖對T細胞活性的增強效應部分與促進IL-2R的表達有關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對免疫活性細胞無直接刺激作用，DC表面存在多糖受體，枸杞多糖可與DC表面存在的多糖受體結(jié)合[11]，啟動和活化DC使其分泌細胞活性因子，活化的DC及其釋放的活性因子的間接作用促進T細胞等免疫活性細胞的功能；同時，T細胞被IL-2等第一信號活化后也可表達多糖受體，與多糖類物質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生協(xié)同效應。這些都表明在培養(yǎng)液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷腫瘤細胞的能力增強。

本研究只是通過上述幾種實驗證明枸杞多糖能促進樹突狀細胞成熟和增強效應T細胞的增殖和殺傷腫瘤的活性。但其具體的分子生物學機制尚需進一步的研究。

[1]Gon GH，Shen P ，Jin L，et al.Therapeutic effects of Lycium barbarum polysaccharide(LBP)on irradiation or chemotherapy-induced myelosuppressivem ice[J].Cancer BiotherRadiopharm，2007，20(2)：155.

[2]Gan L，ZhanGSH，YanGXL，et al.Immunomodulation and ant itumor activity by apolysaccharide protein complex from Lyciumbarbarum[J].IntImmunopharmacol，2006 ，4(4)：563.

[3]Wei H L，Su H X ，Yao X J.Biological feature of human T-activated killer cells[J].Ch in JCancer Res，1999，11(4)：111.

[4]王文濤，周金黃，邢善田，等.海藻硫酸多糖對正常及免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，1994，28(2)：199.

[5]趙瑞景；王慧賢；朱謹波，等.復合中藥多糖的免疫調(diào)變及腫瘤生物治療作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，1995，16(4)：26.

[6]魏虎來，賈正平，趙懷順，等.T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體聯(lián)合硒酸酯多糖抗白血病效應的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，1998 ，18(3)：410.

[7]ZHU Ke-jian.Dendritic cell and autoimmune diseases[J].Journal of Zhe jiang University：Medical Sciences，2003，32(1)：81.

[8]Lanzavecchia A，Sallusto F.Regulation of T cell immunity by dendritic cells[J].Cell，2004，106(3)：263.

[9]LIU Y L.Dendritic cell subsetsand lineages，and their functions in innate and adaptive immunity[J].Cell，2001，106(3)：259.

[10]魏虎來，姚小健，趙懷順，等.植物多糖增強腫瘤殺傷效應細胞的增殖活性和細胞毒活性[J].中草藥，2002，22(3)：141.

[11]Go ldman R.Characteristics of the-glucan receptor of murine macrophages[J].Exp Cell Res，1988，17(4)：481.