李 昆,何海濤,李鴻梅,劉劍凱,洪 敏*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

已有研究表明,嗎啡、海洛因等阿片類物質(zhì)可引起嘌呤核苷酸分解過(guò)度[1,2],而合成代謝降低[3,4]?？梢?jiàn),在長(zhǎng)期使用阿片的過(guò)程中嘌呤核苷酸虧欠可能是造成藥物依賴的機(jī)制之一。外源性補(bǔ)償核苷酸對(duì)海洛因所致的嘌呤核苷酸代謝改變是否有改善作用目前尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在探討補(bǔ)償嘌呤核苷酸對(duì)海洛因依賴大鼠嘌呤核苷酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 正常雄性Wistar大鼠,體重180-200 g,吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK2006)。海洛因由吉林省公安廳提供,純度為98%,用生理鹽水配制后抽濾除菌。單磷酸腺苷(AMP)及單磷酸鳥(niǎo)苷(GMP)為Amersco產(chǎn)品。Trisol RNA提取試劑盒(Gibco公司)、PrimeScript RT Reagents Kit和SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TaKaRa公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI Prism 7000型,USA)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 50只大鼠隨機(jī)分為5組:①對(duì)照組:每日兩次腹腔注射生理鹽水,注射體積及時(shí)間與海洛因組相同,第10天處死。②海洛因組:建立海洛因依賴大鼠模型,第1-9天每日兩次腹腔注射海洛因,每日次劑量依次為 0.50、0.75、1.25、2.00、3.00、4.25、5.75、5.75、5.75 mg·kg-1體重 。 ③海洛因+AMP+GMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射核苷酸(AMP與GMP等摩爾混合),每日次劑量均為 7.5 mg·kg-1體重。④海洛因+AMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射AMP,每日次劑量均為7.5 mg·kg-1體重。⑤海洛因+GMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射GMP,每日次劑量均為7.5mg·kg-1體重。各組大鼠于d 10麻醉、處死后,迅速取大腦皮質(zhì),立即放入液氮中2 h,然后轉(zhuǎn)入到-86℃超低溫冰箱內(nèi)。

1.3 引設(shè)物計(jì) 所有引物(見(jiàn)表1)均用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimer 5.0設(shè)計(jì),由南京金斯特公司合成。

Table 1 Sequences of oligonucleotides used as primers

1.4 RNA抽提 根據(jù)Trisol RNA提取試劑盒的操作步驟提取大腦皮質(zhì)總RNA,核酸測(cè)定儀測(cè)A260/A280,要求在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA-20℃保存。

1.5 SYBR熒光實(shí)時(shí)定量PCR 參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定PCR程序;熔解曲線程序:95℃1 min,65℃15 s,65℃10 s,從65℃緩慢升溫至95℃,每升高0.5℃檢測(cè)一次熒光信號(hào)值。反應(yīng)結(jié)束儀器自動(dòng)生成Ct(threshold cycles)值及熔解曲線圖。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管,同時(shí)設(shè)無(wú)模板陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量采用Pfaffl[5]法進(jìn)行分析,將同一樣本中目的基因的Ct值與內(nèi)參基因的Ct值相減,所得出的Δ Ct為目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)強(qiáng)度,即Δ Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。再使用 2-ΔΔCt方法將目的基因的表達(dá)差異通過(guò)處理樣本相對(duì)于未處理樣本的倍數(shù)來(lái)表示 ,-Δ Δ Ct=-(Δ Ct實(shí)驗(yàn)組 -Δ Ct對(duì)照組)。2-ΔΔCt＞1,目的基因表達(dá)上調(diào),反之下調(diào)。數(shù)據(jù)用±s表示,各組均數(shù)之間比較采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)顯示,海洛因組ADA、黃嘌呤氧化酶(XO)的mRNA比對(duì)照組明顯升高,分別為對(duì)照組的3.3倍和2.7倍(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因組相比明顯降低(P＜0.05)。海洛因組次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)的mRNA比對(duì)照組明顯降低,分別為對(duì)照組的18%,43%和33%(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因組相比有不同程度升高,以HGPRT的升高程度尤為顯著(P＜0.05)。海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組的各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)顯著性,見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 大鼠腦組織中APA、XO、AK、APRT、HGPRT相對(duì)表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR法檢測(cè)ADA,XO,AK,APRT,HGPRT mRNA的表達(dá),以探討外源性補(bǔ)償嘌呤核苷酸對(duì)海洛因所致的嘌呤核苷酸分解代謝增強(qiáng)、合成代謝減弱是否有改善作用。該方法在應(yīng)用過(guò)程中需結(jié)合熔解曲線分析來(lái)確定PCR產(chǎn)物的特異性[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熔解曲線分析,確定PCR反應(yīng)特異性好,反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)可反映擴(kuò)增產(chǎn)物含量的實(shí)時(shí)變化。結(jié)果分析采用相對(duì)定量Pfaffl法,首先通過(guò)構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)五種基因擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測(cè),在此基礎(chǔ)上,用β-actin對(duì)各組RNA作均一化處理,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組的各目的基因mRNA表達(dá)的差異倍數(shù)。

腺嘌呤核苷脫氨酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤核苷酸分解代謝的關(guān)鍵酶,ADA催化腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸,進(jìn)而分解成次黃嘌呤;XO催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,再催化黃嘌呤分解為尿酸。因此,ADA和XO的活性可衡量嘌呤核苷酸分解代謝狀況。本實(shí)驗(yàn)中海洛因組腦皮質(zhì)中ADA和XO mRNA水平顯著高于對(duì)照組,海洛因+AMP+GMP組ADA和XO mRNA水平雖明顯高于對(duì)照組,但比海洛因組有大幅度的降低,說(shuō)明海洛因促進(jìn)皮質(zhì)ADA和XO mRNA的表達(dá),而同時(shí)補(bǔ)償嘌呤核苷酸可抑制海洛因的作用。

次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)是補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶。本實(shí)驗(yàn)中海洛因組腦皮質(zhì)HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量均比對(duì)照組明顯降低,而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量比海洛因組明顯升高,與對(duì)照組水平相近,說(shuō)明海洛因抑制腦皮質(zhì)HGPRT,APRT,AK mRNA的表達(dá),該作用可被同時(shí)補(bǔ)償嘌呤核苷酸抑制。

海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因+AMP+GMP組相比,各目的基因mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著性差異,這與體內(nèi)嘌呤核苷酸的相互轉(zhuǎn)變有關(guān)。單純補(bǔ)充AMP或GMP與同時(shí)補(bǔ)充AMP和GMP相比,對(duì)海洛因依賴大鼠各目的基因mRNA表達(dá)量的影響無(wú)明顯差異。

綜上所述,海洛因給藥可以使大腦皮質(zhì)ADA及XO mRNA表達(dá)增強(qiáng),HGPRT、APRT和AK mRNA表達(dá)降低,提示海洛因在基因水平上促進(jìn)嘌呤核苷酸分解代謝,降低合成代謝,而補(bǔ)償嘌呤核苷酸可抑制上述作用。嘌呤核苷酸因其所表現(xiàn)出來(lái)的對(duì)海洛因的拮抗作用有望成為治療海洛因依賴的工具。

[1]Chang LIU,Jian-kai LIU,Mu-jie KAN,et al.Morphine enhances purine nucleotide catabolism in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacologica Sinica,2007,28(8):1105.

[2]Yu-dan Yang,Ji-zhou Zhang,Cong Sun,et al.Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo[J].Life Sciences2006,78:1413.

[3]Liu JK,Hong M,Zhao XD.Effect of morphine on expression of gene of enzymes related to purine nucleotide metabolism in C6glioma[J].Chinese Medical Journal-Peking,2003,83(1),46.

[4]閆曉凱,洪 敏,劉 暢,等.嗎啡在基因水平對(duì)腦嘌呤核苷酸代謝的影響[J].中國(guó)藥物依賴性雜志,2005,14(3):187.

[5]Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2001,29(9):e45.

[6]何淑芳,楊林,黃維娟.應(yīng)用SYBR熒光實(shí)時(shí)定量 RT2PCR法檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PA I-1 mRNA表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009,25(1):64.