夏茂盛，朱悅，高靜杰

（1.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；2.遼河油田第二職工醫(yī)院 麻醉科，遼寧 盤錦 124010）

纖維黏連蛋白（fibronectin）是一種間盤細胞外基質糖蛋白，可以被基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP） 分解為纖維黏連蛋白碎片（fibronectin fragments，Fn-f）［1］。在間盤退變過程中，Fnf是一種退變的產物，其含量明顯增加。同時研究表明，Fn-f又具有誘導間盤退變的作用［2］。將Fn-f注入髓核內，間盤出現了退變樣改變；將Fn-f加入間盤細胞的培養(yǎng)液，間盤細胞基質蛋白的合成明顯減少，而 MMP 的表達明顯增加［3，4］。然而目前 Fn-f誘導間盤退變的具體機制并不清楚。而纖維黏連蛋白和 Fn-f在細胞膜上主要的受體是整合素 α5β1［5，6］。因此，本實驗將Fn-f加入髓核細胞的培養(yǎng)液，觀察Fn-f對其受體整合素α5和β1亞基表達的影響，探討Fn-f誘導間盤退變的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物為日本大耳白兔，3月齡，10只，體質量（2 500±200）g；試劑為纖維黏連蛋白碎片（110 kDa，Sigma）、用于免疫沉淀的整合素α5和β1亞基抗體和蛋白G瓊脂糖小球（upstate biotechnology）、用于Western blot和免疫熒光的鼠抗整合素 α5、β1、II型膠原蛋白、MMP9和MMP13的單克隆抗體（SantaCruz）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離和培養(yǎng)：無菌取出兔間盤髓核組織，0.2%的膠原酶消化4 h，用D-Hanks進行酶液清洗3次。然后用培養(yǎng)液DMEM/F12+15%胎牛血清重懸細胞，以2×104/cm2接種于培養(yǎng)皿內，置于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。約6～7 d后，待細胞貼壁完全第1次換液，以后隔2～3 d換液，細胞生長到80%融合后，用0.25%胰酶消化傳代。第3代細胞長到70%～80%融合后，將培養(yǎng)液去除，實驗組加入含有Fn-f的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，Fn-f的濃度為100nmol/L，對照組則只加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)2 d。

1.2.2 Western免疫印跡：培養(yǎng)2 d后，去除培養(yǎng)液，加入裂解液，收集細胞裂解液，用Bradford法測各個樣品蛋白含量。比較兩組間整合素α5和β1含量，取實驗組和對照組樣品各1 000μg加入8μg抗-整合素亞型（α5或 β1）的抗體，4 °C 孵育 12 h。然后向樣品中加入200μl蛋白G瓊脂糖小球，4°C孵育2 h。離心（14 000 g，5 s）收集瓊脂糖小球，并在沸水中煮5 min。取上清加入準備好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離樣品。而比較II型膠原蛋白、MMP9、MMP13在兩組間含量時，樣品蛋白含量定量后，每組樣品取的蛋白量一致，均為50μg，直接將樣品加入準備好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離樣品。以后實驗步驟相同，電泳分離樣品后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。封閉后，在膜上分別加入鼠整合素亞型 （α5、β1）、II型膠原蛋白、MMP9 和MMP13的特異性一抗，1∶1 000稀釋，孵育2 h。洗膜1 h后，加入羊抗鼠的二抗，辣根過氧化物酶標記，1∶2 000稀釋，孵育2 h。最后纖維素膜用ECL底物顯影到膠片上，以β-actin為內參，結果用圖像分析軟件進行分析。

1.2.3 免疫熒光：細胞培養(yǎng)2 d以后，將培養(yǎng)液倒出，用PBS稍洗細胞，然后在-20°C條件下用純甲醇固定6 min。固定后的細胞經PBS稍洗細胞后，封閉30 min，然后加入一抗，鼠抗兔的針對整合素α5亞基和Ⅱ型膠原蛋白的一抗同時加入，針對整合素β1亞基和Ⅱ型膠原蛋白的一抗同時加入，4°C過夜。洗去一抗后，加入TRITC和FITC結合的二抗，室溫2 h。然后PBS洗細胞30 min，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）：將細胞裂解后，應用Trizol等提取總核糖核酸（RNA）。用TAKARA試劑盒，將提取的RNA逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增，引物見表1。反應條件是94℃2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分離PCR擴增產物。經紫外分光儀比較PCR產物的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗結果利用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析，多樣本采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 用于RT-PCR的引物序列Tab.1 The sequences of the primers used for RT-PCR

2 結果

2.1 細胞形態(tài)的變化

加入Fn-f后髓核細胞形態(tài)變化明顯，細胞體積縮小，有多角形轉變?yōu)榧氶L形，并可見少量細胞碎裂，細胞內和細胞間顆粒樣物質明顯增多（圖1）。

2.2 蛋白表達的變化

經Fn-f作用后，整合素 α5、β1亞基和MMP9、MMP13的含量都明顯增加，與對照組相比均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而Ⅱ型膠原蛋白的含量明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。免疫熒光技術觀察到整合素α5、β1均表達在細胞膜上，經Fn-f作用后，這兩種蛋白在胞膜上的熒光強度明顯增強，而Ⅱ型膠原蛋白的熒光強度明顯降低（圖 2）。

2.3 基因表達的變化

經 Fn-f作用后，整合素 α5、β1亞基、MMP9、MMP13的表達均明顯升高，而Ⅱ型膠原蛋白的表達明顯降低（圖3）。

3 討論

表2 兩組整合素α5、β1亞基、MMP9、MMP13和II型膠原蛋白含量的比較Tab.2 The comparison of integrinα5,β1 subunits,MMP9,MMP13 and collegen IIprotein content

本實驗發(fā)現，Fn-f可以誘導間盤髓核細胞退變。在加入Fn-f后，髓核細胞的Ⅱ型膠原蛋白表達降低，而MMP9和MMP13的表達明顯升高。在Fn-f的干預下，整合素α5β1的表達增加，這說明Fn-f有促進其受體表達增加的作用。

Fn-f是間盤退變過程中纖維黏連蛋白的分解產物，在退變間盤內的含量明顯增加［8］。究其原因有兩方面，一方面是纖維黏連蛋白在退變間盤內的表達增多［9，10］，另一方面在退變過程中MMP的表達明顯增加，而正是MMP將纖維黏連蛋白分解為Fn-f［11］。體內和體外實驗都證明了Fn-f有減少糖蛋白表達，促進基質蛋白分解的作用［2～4］。本實驗同樣證明了這個結論，Fn-f減少了II型膠原蛋白的表達，增加了MMP9和MMP13的表達。但Fn-f誘導間盤退變的具體機制并不清楚。而Fn-f同樣有誘導軟骨退變的作用，發(fā)現Fn-f在軟骨細胞膜上的受體是整合素 α5β1［12，13］，并且 Fn-f有增加整合素 α5和 β1亞基表達的作用［14］。整合素α5和β1亞基在間盤內同樣有表達［7］，而且整合素α5β1是纖維黏連蛋白和Fn-f在間盤細胞膜上主要的受體［5］。因此，本實驗研究了在Fn-f作用下的髓核細胞整合素α5和β1亞基的表達情況，發(fā)現α5和β1亞基表達明顯增加。

研究Fn-f的退變機制時，Homandberg提出Fn-f的作用由Fn-f、MMP、纖維黏連蛋白、II型膠原蛋白組成的正反饋惡性循環(huán)，即Fn-f增加了MMP的表達，增加的MMP分解纖維黏連蛋白形成更多的Fnf，而II型膠原蛋白的表達減少是這個惡性循環(huán)的最終結局［15］，本實驗結果與這個理論一致。本研究同樣發(fā)現Fn-f有促進整合素α5、β1亞基表達作用。由于整合素α5β1在Fn-f誘導間盤退變過程中起到了膜受體的作用，而Fn-f又有促進其受體表達增加的作用，那么可以將整合素α5β1納入這個正反饋惡性循環(huán)，即Fn-f與髓核細胞膜上的整合素α5β1結合后，影響了髓核細胞的代謝，MMP和受體整合素α5β1的表達都增加，MMP分解纖維黏連蛋白使Fn-f的量增加，而整合素α5β1表達的增加使Fn-f的結合位點增多，促進了Fn-f誘導髓核細胞退變的作用。因此，整合素α5β1既是Fn-f在間盤細胞上的受體，同時又是Fn-f誘導間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的關鍵環(huán)節(jié)。

綜上，本實驗測定了Fn-f對于間盤髓核細胞的影響，初步探討了Fn-f對于間盤整合素α5β1表達的影響。但由于本實驗只是體外培養(yǎng)環(huán)境下進行的研究，體內環(huán)境下Fn-f誘導間盤退變的機制有待進一步的研究。

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