李淑杰，羅弋，龐華，李少林

（重慶醫(yī)科大學(xué)1.放射醫(yī)學(xué)教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤學(xué)研究中心，重慶 400016；2.附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，重慶 400016）

Prx I是過氧化物酶（peroxiredoxins，Prxs）的2-Cys亞家族成員，定位于細(xì)胞質(zhì)，在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)［1］。Prx I可減少活性氧自由基的產(chǎn)生，其表達(dá)上調(diào)可增強腫瘤抗氧化能力，是腫瘤抗凋亡和耐藥的重要原因［2］，可作為肺癌治療的靶點［3］。

完全人源化的噬菌體抗體作為第三代基因工程抗體的代表，克服了傳統(tǒng)抗體的異源性、血清清除速率慢［4，5］、療效較低及制備工藝復(fù)雜等弊端，為腫瘤的抗體診斷和治療帶來新的選擇。本研究以Prx I為靶點，利用噬菌體展示技術(shù)制備人源化肺癌抗體，并偶聯(lián)放射性核素，進(jìn)行抗體放免顯像及治療的研究，為進(jìn)一步臨床抗體制劑開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體為本實驗室自行制備［6］；人肺腺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫；BALB/c裸鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量20～26 g，4～6周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心；peroxiredoxin I抗原購自美國BPS公司；兔抗人Prx I多抗購自英國ABCAM公司；HRP/羊抗兔IgG二抗購自美國SAB公司；放射性核素Na131I、Na125I均購自中國原子能科學(xué)研究院；SN-684型放射免疫γ計數(shù)儀為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品；SPECT顯像儀器采用德國SIEMENS Symbia T2 SPECT儀。

1.2 可溶抗體細(xì)胞內(nèi)攝量測定

氯胺T法125I標(biāo)記抗體并純化。肺腺癌A549細(xì)胞中加入125I-scFv（1.5×106cpm/1×104cells），37 ℃孵育30 min和120 min，以4℃孵育細(xì)胞為對照，各做3次。孵育結(jié)束后分別PBS液洗滌細(xì)胞3次，再以冰預(yù)冷甘氨酸緩沖液（0.1 mol/L glycine-HCl，2 mol/L urea，pH2.2）洗3 次，每次2min，以洗脫細(xì)胞表面結(jié)合的125I-scFv，收集洗脫液。再以2%SDS溶解細(xì)胞，收集溶胞產(chǎn)物。分別用γ計數(shù)儀測洗脫液和溶胞產(chǎn)物放射性計數(shù)。

1.3 細(xì)胞生長抑制檢測

將 A549細(xì)胞（3×104/ml）接種 96孔板（100 μl/well），設(shè)立空白對照組，各組3個復(fù)孔。72 h后行MTT法檢測（490 nm）細(xì)胞增殖情況。

將 A549細(xì)胞（1×106/ml）接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液體積1ml。加入1ml scFv（0.5 μmol/L）。72 h 后消化細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI雙染法上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.4 A549細(xì)胞Prx I蛋白表達(dá)

將A549細(xì)胞（5×106/ml）接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。加入1 ml scFv（0.5 μmol/L）。設(shè)空白對照（以PBS替代scFv抗體）。72 h后Western blot檢測Prx I蛋白表達(dá)水平，以兔抗人Prx I多抗為一抗，HRP/羊抗兔IgG為二抗。計算Prx I蛋白條帶與β-actin內(nèi)參條帶光密度比值，以其表示Prx I蛋白表達(dá)的相對強度。

1.5 scFv的131I標(biāo)記及鑒定

氯胺T法標(biāo)記抗體后將標(biāo)記反應(yīng)液注入1×15 cm Sephadex G200柱，用0.01 mol/L PBS洗脫純化。三氯醋酸沉淀法計算標(biāo)記率。以正丁醇和乙酸混合液為展開劑，紙層析法測定標(biāo)記物的放射性化學(xué)純度和比活度。

1.6 荷瘤裸鼠模型的建立

對數(shù)生長期肺腺癌A549細(xì)胞以5×106cell/200 μl濃度接種于裸鼠右前肢后方皮下。觀察生長情況，待腫瘤直徑長至0.7～1.0 cm時用于下一步實驗。

1.7 生物分布測定

每只荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv200 μl（約18.5 MBq），共注射12只，并隨機分為4組。分別于注射后12 h、24 h、48 h和72 h處死各組裸鼠，剝離腫瘤組織及主要器官，稱質(zhì)量，用γ計數(shù)儀測定放射性計數(shù)，計算每克組織百分注射劑量率（%ID/g）。

1.8 放射免疫顯像

取3只荷瘤裸鼠，注射131I-scFv前3 d以1%KI封閉甲狀腺。每只裸鼠分別于尾靜脈注射200 μl新鮮配制的131I-scFv（約18.5 MBq）。將裸鼠固定后在注射核素標(biāo)記抗體后12 h、24 h、48 h和72 h分別進(jìn)行SPECT顯像。儀器采用高分辨準(zhǔn)直器，距陣256×256，能峰364 keV，計數(shù)25 K-30 K，2倍放大。以腫瘤部位對側(cè)組織為感興趣區(qū)（region of interest，ROI），測定靶器官/周圍組織（T/NT）值。

1.9 荷瘤裸鼠分組治療觀察

將15只荷瘤裸鼠隨機分為3組：生理鹽水對照組（注射生理鹽水0.1 ml）、131I-IgG治療組（注射131IIgG約20 MBq）和131I-scFv治療組（注射131I-scFv約20 MBq），1次/2 d，共14次。游標(biāo)卡尺每3 d測量一次腫瘤最大直徑（a）和最大垂直直徑（b）。4周后處死裸鼠，剝離腫瘤組織、稱重，計算抑瘤率IR=（Vo-Vn）/Vo×100%，Vo為對照組腫瘤體積，Vn為治療組腫瘤體積。4周后處死各組裸鼠，剝離腫瘤組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋后作病理切片，HE染色后觀察病理學(xué)改變。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞內(nèi)攝可溶抗體

溶胞產(chǎn)物的放射性計數(shù)評估細(xì)胞內(nèi)攝125I-scFv量，甘氨酸洗脫液和溶胞產(chǎn)物總和的放射性計數(shù)評估細(xì)胞結(jié)合125I-scFv的總量。經(jīng)γ計數(shù)儀測定，120 min時間點細(xì)胞結(jié)合抗體的總量及內(nèi)攝量均為30 min時間點的2倍。內(nèi)攝抗體量占細(xì)胞總結(jié)合抗體量的比例在2個時間點保持相對穩(wěn)定，分別為40.3%（30 min）和 44.7%（120 min）。

2.2 MTT法及流式細(xì)胞術(shù)評價細(xì)胞生長、凋亡情況

單鏈抗體scFv作用于A549細(xì)胞72 h后進(jìn)行MTT分析?？梢妔cFv對細(xì)胞有劑量依賴的抗增殖作用（圖1）。AnnexinV-FITC/PI法流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡，scFv干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加（圖2）。

2.3 Prx I蛋白表達(dá)水平測定

可溶單鏈抗體scFv干預(yù)A549細(xì)胞72 h后，提取總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測?？梢姌悠方MPrx I蛋白表達(dá)水平低于空白對照組（P＜0.05）（圖3）。結(jié)果證實可溶抗體scFv干預(yù)后細(xì)胞Prx I蛋白表達(dá)受到抑制。

2.4 131I-scFv的標(biāo)記結(jié)果

三氯乙酸沉淀法測得131I-scFv標(biāo)記率為（83.2±6.5）%。131I-scFv的放射化學(xué)純度為（95.6±3.7）%，比活度為（2.8±0.2）MBq/μg。

2.5 131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布

測定12只荷瘤裸鼠腫瘤、血液、肝、腎、脾、腸、肌肉等器官組織的放射性。在48 h腫瘤攝取131I-scFv抗體量達(dá)（3.78±0.65）%ID/g。此時瘤/血放射性比值和瘤/肌肉放射性比值均達(dá)最大值，分別為4.06±0.13 和5.17±0.97。

2.6 放射免疫顯像

結(jié)果顯示，腫瘤部位有放射性核素濃聚，可見腫瘤清晰顯像。勾畫ROI，計算T/NT值。12h、24 h、48 h 和 72 h 分別為1.26±0.15、2.18±0.16、3.73±0.20 和2.85±0.18。48 h顯像的T/NT值明顯高于其他時間點（F均＞86，P 均＜0.01），且腫瘤顯示最清晰（圖4）。

2.7 各組裸鼠治療效果比較

治療4周后131I-scFv組腫瘤質(zhì)量［（2.37±0.58）g］、體積［（1.36±0.33）cm3］較其他2組有明顯降低，抑瘤率56.8%，抑瘤作用明顯，而其他2組間無明顯差異。將各組腫瘤切片后HE染色鏡下觀察。與空白對照組比較，131I-scFv治療組腫瘤切片可見大片腫瘤細(xì)胞壞死，核碎裂、核溶解明顯，細(xì)胞間質(zhì)呈紅染無結(jié)構(gòu)物質(zhì)（圖5）。

3 討論

噬菌體抗體以其制備簡便、可以規(guī)模化生產(chǎn)及完全人源化的優(yōu)勢，在臨床腫瘤治療中成為新的選擇和補充［7，8］。經(jīng)檢測，本實驗室前期制備的抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體與高表達(dá)Prx I的肺腺癌A549細(xì)胞有較強的特異性結(jié)合活性，為抗體的體內(nèi)分布及抑瘤作用研究提供了保證。

因為抗體庫的篩選是在體外以腫瘤細(xì)胞及純化的Prx I作為靶抗原進(jìn)行的，因此有必要在體內(nèi)對抗體結(jié)合高表達(dá)Prx I肺腺癌組織的能力進(jìn)行檢測。本研究觀察到抗體在腫瘤部位得到有效濃聚，而腸、肝及腎臟對抗體的攝取也較高。在注射后12 h，瘤/血比值和瘤/肌肉比值分別是0.77和1.65，并且在第48 h均達(dá)到最大值，分別為4.06和5.17。SPECT也提示相同的結(jié)果，注射后12 h時胃腸和腎臟是主要的非特異性攝取器官，但隨著注射后時間的延長，腫瘤部位顯像越來越清晰，而到第48 h時腫瘤顯像最為清晰，非特異性攝取明顯減少。并且由于代謝的原因，此時腫瘤顯像較第72 h時更為清晰。

抗體的治療作用研究是接下來需要考察的內(nèi)容。已有研究表明，噬菌體單鏈抗體與細(xì)胞表面分子的結(jié)合內(nèi)攝可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重要的生理進(jìn)程，具有內(nèi)在的抗增殖活性［9］。我們的前期研究中，采用肺腺癌患者癌旁淋巴結(jié)組織作為抗體基因來源，制備得到了特異性較好的抗Prx I肺腺癌相關(guān)噬菌體抗體。在本研究的體外抑制肺腺癌細(xì)胞生長實驗中，證實了單鏈抗體與A549細(xì)胞結(jié)合后能被有效內(nèi)攝進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并介導(dǎo)了劑量相關(guān)的抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)，觀察到靶細(xì)胞凋亡的增加，以及細(xì)胞內(nèi)Prx I蛋白表達(dá)量的下降。基于以上結(jié)果，可以推測抗體的抗增殖作用是因為內(nèi)攝的抗體限制了細(xì)胞受體數(shù)量，并且在與Prx I表位結(jié)合后，降低了腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖抑制和凋亡。關(guān)于該抗體抑制肺腺癌細(xì)胞生長的機制，需要進(jìn)一步的深入研究。在荷瘤裸鼠模型進(jìn)行的核素標(biāo)記抗體放免治療實驗中，通過靜脈給藥，也同樣觀察到腫瘤體積和質(zhì)量的減小，證實了131I標(biāo)記單鏈抗體用于放免治療的可行性和有效性。

噬菌體單鏈抗體作為最具應(yīng)用潛力的治療性抗體，在腫瘤抗體治療中揮發(fā)日益重要的作用。本研究利用以肺腺癌細(xì)胞及其高表達(dá)的Prx I作為治療靶點的噬菌體抗體進(jìn)行抗體體內(nèi)分布及抑瘤作用研究，證實抗體具有良好的藥代動力學(xué)特性，與131I標(biāo)記后能有效抑制肺腺癌腫瘤的生長，具有進(jìn)一步開發(fā)制備腫瘤放免顯像及治療藥物的應(yīng)用潛力。

［1］Chang JW，Lee SH，Jeong JY，et al.Peroxiredoxin I is an autoimmunogenic tumor antigen in non-small cell lung cancer［J］.FEBS Lett，2005，579（13）：2873-2877.

［2］Chang JW，Jeon HB，Lee JH，et al.Augmented expression of Peroxiredoxin I in lung cancer［J］.Biochem Biophy Res Commun，2001，289（2）：507-512.

［3］Kim JH，Bogner PN，Baek SH，et al.Up-regulation of peroxiredoxin1in lung cancer and its implication as a prognostic and therapeutic target［J］.Clin Cancer Res，2008，14（8）：2326-2333.

［4］Xiao J，Horst S，Hinkle G，et al.Pharmacokinetics and clinical evaluation of125I-radiolabeled humanized CC49 monoclonal antibody（HuCC49deltaC（H）2）in recurrent and metastatic colorectal cancer patients［J］.Cancer Biother Radiopharm，2005，20（1）：16-26.

［5］Weiner LM.Fully human therapeutic monoclonal antibodies ［J］.J Immunother，2006，29（1）：1-9.

［6］羅弋，龐華，李少林，等.人源抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌體抗體的制備及鑒定［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（1）：30-34.

［7］Yamashita T，Utoguchi N，Suzuki R，et al.Development of anti-tumor blood vessel antibodies by phage display method ［J］.Yakugaku Zasshi，2010，130（4）：479-485.

［8］Majidi J，Barar J，Baradaran B，et al.Target therapy of cancer：implementation of monoclonal antibodies and nanobodies ［J］.Hum Antibodies，2009，18（3）：81-100.

［9］Liu B，Conrad F，Cooperberg MR，et al.Mapping tumor epitope space by direct selection of single-chain Fv antibody libraries on prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2004，64（2）：704-710.