王振華，劉云會，薛一雪

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1；2.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 1 1 0 0 0 4；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

近年來，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類疾病的基因治療中。它具有安全性較好且轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)點，但其應(yīng)用在某些科學(xué)領(lǐng)域也存在一定的局限性，例如體外轉(zhuǎn)染腺病毒載體可干擾原代培養(yǎng)的某類細胞的一些特定功能。有文獻報道，表達β半乳糖苷酶（βgal）基因的腺病毒載體以20 MOI的劑量轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的垂體前葉細胞，將影響該細胞激素的分泌及細胞增殖［1］。在原代培養(yǎng)的牛腎上腺皮質(zhì)等細胞中，攜帶某種基因的腺病毒載體也會不同程度地改變這些細胞分泌激素等功能［2］。盡管腺病毒載體已成功用于在體或離體培養(yǎng)的內(nèi)分泌細胞的基因轉(zhuǎn)移，尤其是垂體前葉細胞［3，4］，但鮮有在內(nèi)分泌細胞中轉(zhuǎn)染腺病毒載體效應(yīng)的報道。如果腺病毒載體本身對靶細胞的功能產(chǎn)生影響，將使腺病毒載體的應(yīng)用嚴(yán)重受限。因此，了解腺病毒載體和靶細胞的相互作用對于腺病毒載體的成功應(yīng)用具有重要意義。本研究觀察腺病毒載體對原代培養(yǎng)的大鼠垂體催乳素細胞增殖功能的影響，并進一步探討其可能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

7周齡雌性Wistar ST大鼠126只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。腺病毒表達質(zhì)粒，購自Clontech公司；磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding pro－tein，pCREB）抗體，購自 Cell Signaling公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體，購自O(shè)ncogene公司。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒載體制備：腺病毒載體（Ad-prl/βgal、Ad-CMV/empty、Ad-CRE/Luc）的制備參照Adeno-X表達系統(tǒng)說明書（Clontech Laboratories，Mountain View，USA）和參考文獻［5］完成。

1.2.2 垂體前葉細胞的培養(yǎng)及分組：Wistar ST大鼠用乙醚麻醉后斷頭，無菌條件下開顱取出垂體，去除后葉。將垂體前葉置于S-MBH的培養(yǎng)皿中，用眼科剪把前葉組織切成細小的碎片，用0.1%的胰蛋白酶消化，37℃振蕩水浴40 min，用吸管吹打細胞后終止消化，細胞懸液經(jīng)1 100 r/min離心10 min，棄掉上清，滴加DMEM/F12培養(yǎng)液，使垂體前葉細胞再懸浮分散。鏡檢計數(shù)后，將100 μl的2×106/ml細胞懸液滴于多聚賴氨酸處理的35 mm培養(yǎng)皿中，以垂體前葉細胞培養(yǎng)皿為觀察單位，隨機分為對照組（細胞未轉(zhuǎn)染腺病毒載體）、Ad-βgal轉(zhuǎn)染組和Ad-empty轉(zhuǎn)染組（未攜帶外源性基因的空腺病毒載體，腺病毒載體劑量為5 MOI）3組，每組8個皿。腺病毒載體轉(zhuǎn)染組先加入合適劑量的腺病毒載體于細胞懸液中混勻后，再滴入培養(yǎng)皿中，而后置于37℃、5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。

1.2.3 X-gal組化方法鑒定腺病毒載體轉(zhuǎn)染的效果：腺病毒載體感染垂體細胞72 h，3%多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min，含1%Tween20的TBS孵育30 min，加入 X-gal染色液（1 mg/ml X-gal、5 mmol/L鐵氰酸三鉀、5 mmol/L鐵氰酸四鉀、2 mmol/L氯化鎂溶于PBS），37℃孵育1 h，封片。計數(shù)腺病毒感染的藍染陽性細胞率。

1.2.4 5-溴-2′-脫氧尿苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine，BrdU）標(biāo)記法檢測轉(zhuǎn)染腺病毒載體后的大鼠垂體催乳素細胞的增殖功能：細胞培養(yǎng)第3天，對照組、Adβgal轉(zhuǎn)染組和Ad-empty轉(zhuǎn)染組均給予200 μmol/L BrdU，培養(yǎng)3 h，終止培養(yǎng)，收集細胞，用冰甲醇固定，然后用BrdU抗體和催乳素（prolactin，PRL）抗體做雙重免疫細胞熒光染色［6］，封片后用熒光顯微鏡觀察并照相，每個玻片隨機選擇1 000個PRL免疫陽性細胞，計算BrdU標(biāo)記指數(shù)，即PRL和BrdU均陽性的細胞占PRL陽性細胞的百分比。BrdU標(biāo)記的陽性細胞呈紅色熒光，定位于胞核。所用抗體如下：兔抗大鼠 PRL一抗（NIDDK IC-5，1∶4 000）/FITC標(biāo)記的抗兔IgG（Amersham公司，1∶50）；小鼠多克隆抗 BrdU（Sigma 公司，1∶200）/生物素化抗小鼠IgG（Vector公司，1∶50）/Texas Red抗鏈霉素蛋白（Amersham 公司，1∶50）。

1.2.5 免疫熒光方法檢測轉(zhuǎn)染腺病毒載體的催乳素細胞中pCREB蛋白的表達：催乳素細胞分為未轉(zhuǎn)染腺病毒載體（vehicle）組、胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）組、Ad-empty 轉(zhuǎn)染組、Adempty+IGF-1 組、Ad-βgal轉(zhuǎn)染組和 Ad-βgal+IGF-1組。IGF-1處理組為細胞培養(yǎng)第3天加入30 ng/ml IGF-1培養(yǎng)3 h，然后用2%多聚甲醛固定細胞，含1%Tween20的TBS孵育細胞30 min后，3%H2O2孵育細胞10 min，封閉緩沖液封閉30 min后，用pCREB（Ser133）抗體和PRL抗體做雙重免疫細胞熒光染色［7］，用Photoshop軟件定量分析胞核內(nèi)FITC的熒光強度，計算各組PRL免疫陽性細胞中pCREB蛋白陽性表達率。所用抗體如下：單克隆兔抗 pCREB 一抗（1∶100），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗兔IgG（1∶100），辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗FITC抗體（1∶200），Tyramide-FITC（1∶50），小鼠抗 PRL 抗體（1∶30 000），Alexa Fluor 594 標(biāo)記抗小鼠 IgG（1∶100）。1.2.6 熒光素酶報告基因方法檢測轉(zhuǎn)染腺病毒載體的催乳素細胞中cAMP反應(yīng)元件（cAMP response element，CRE）基因的表達：每組在制備細胞懸液時，分別加入0.5 MOI的Ad-CRE/Luc。垂體細胞培養(yǎng)第3 天，用 400 μl裂解液（Promega）裂解細胞，收集細胞，4℃、15 000 r/min離心2 min，采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組中CRE元件熒光的表達水平，應(yīng)用分光光度計檢測各組細胞的熒光強度，以每組熒光強度倍數(shù)來反映各組細胞中CRE的熒光表達活性。

1.2.7 Western blot方法檢測腺病毒載體對垂體前葉細胞中PCNA表達的影響：各組分別接種濃度為3.0×106/ml的大鼠垂體前葉細胞懸液300 μl于35 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入100 μl裂解液，15 min后收集細胞，4℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取各組的等量蛋白在12.5%SDS-PAGE中電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，在1∶1 000稀釋的單克隆小鼠抗PCNA抗體中4℃孵育過夜，經(jīng)TBS充分洗膜后，室溫下與1∶8 000稀釋的二抗結(jié)合 1 h，ECL 法顯色。以 β-actin（1∶10 000）為內(nèi)對照，所得圖像用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，測得整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒載體轉(zhuǎn)染垂體前葉細胞效率的鑒定

X-gal染色結(jié)果顯示，Ad-βgal轉(zhuǎn)染組垂體前葉細胞藍染，經(jīng)KS400圖像分析系統(tǒng)計算，報告基因βgal經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)移到垂體前葉細胞中的轉(zhuǎn)染效率為（55.9±2.3）%。見圖 1。

2.2 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的影響

BrdU和PRL雙重免疫熒光結(jié)果顯示，催乳素細胞陽性細胞呈綠色熒光，定位于胞質(zhì)；胞質(zhì)呈綠色、胞核呈紅色的細胞為BrdU標(biāo)記陽性的催乳素細胞，垂體前葉細胞轉(zhuǎn)染Ad-empty或Ad-βgal后顯著增加催乳素細胞的基礎(chǔ)增殖（P<0.01）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對催乳素細胞CRE元件表達的影響

CREB蛋白可與CRE元件特異性結(jié)合，發(fā)揮重要的核轉(zhuǎn)錄因子的作用。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ad-empty或Ad-βgal的垂體細胞CRE元件的表達活性顯著增高（P<0.01）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對催乳素細胞pCREB蛋白表達的影響

pCREB和PRL雙重免疫熒光結(jié)果顯示，催乳素細胞胞質(zhì)呈紅色熒光染色，pCREB陽性表達定位于細胞核，呈綠色熒光染色。胞質(zhì)呈紅色、胞核呈綠色的細胞為pCREB表達免疫陽性的催乳素細胞。與 IGF-1組相比，Ad-empty+IGF-1組和 Ad-βgal+IGF-1組催乳素細胞pCREB的表達活性顯著增加（P<0.01）。Ad-empty 轉(zhuǎn)染組和 Ad-βgal轉(zhuǎn)染組pCREB的表達顯著高于未轉(zhuǎn)染腺病毒載體組（P<0.01）。見圖 4。

2.5 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對垂體前葉細胞PCNA表達的影響

PCNA是一種相對分子量為36 kDa的細胞周期調(diào)控蛋白，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Ad-empty轉(zhuǎn)染組和Ad-βgal轉(zhuǎn)染組垂體細胞內(nèi)PCNA蛋白的表達顯著增強，其條帶IDV值顯著高于對照組（P<0.01）。見圖5。

3 討論

在基因治療和免疫療法中，腺病毒載體由于其轉(zhuǎn)基因效率高，且容易獲得高滴度和純度的載體，愈來愈受到研究者們的重視。催乳素增高的垂體瘤是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見疾病，深入研究導(dǎo)致催乳素細胞異常增殖的影響因素對于探究垂體瘤的病因及發(fā)病機制具有重要意義。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細胞為模型，深入探討了腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的影響及可能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。本研究發(fā)現(xiàn)，表達βgal基因的腺病毒載體及未攜帶外源性基因的空腺病毒載體均明顯增強催乳素細胞的基礎(chǔ)增殖，提示腺病毒載體本身即可改變催乳素細胞的增殖功能，而且垂體前葉細胞在感染以上2種腺病毒載體后，細胞內(nèi)CRE的活性及pCREB蛋白、PCNA蛋白的表達較對照組亦明顯增高。

CRE元件是一段約30 bp構(gòu)成的DNA片段，這段序列主要存在于許多靶基因的啟動子與增強子上，而CREB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被磷酸化激活以后可選擇性結(jié)合CRE，刺激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。CREB可被諸多蛋白激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，其作用非常廣泛，如促進細胞增殖、分化、存活，促進學(xué)習(xí)記憶等［8，9］。有實驗證明，CREB 磷酸化以后在維持原代培養(yǎng)的催乳素細胞增殖功能中起重要的調(diào)節(jié)作用，下調(diào)CREB基因表達或抑制CRE轉(zhuǎn)錄活性可降低催乳素細胞的基礎(chǔ)增殖［7］。本研究采用熒光素酶報告基因和定量雙重免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)垂體前葉細胞轉(zhuǎn)染重組腺病毒載體后，可顯著增強CRE的活性和pCREB的表達，因此我們推測CREB可能參與了腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的改變。

CREB調(diào)節(jié)的下游靶基因中包括許多與細胞增殖相關(guān)的基因如 c-fos、cyclins A、cyclins D、PCNA等，CREB被激活后可能通過上調(diào)這些基因的表達來刺激細胞的增殖［7，10，11］。PCNA 是一種細胞核內(nèi)合成的分子量為36 kDa的蛋白質(zhì)，其功能與DNA合成密切相關(guān)。檢測細胞中PCNA的表達水平可較好地反映細胞增殖狀態(tài)，尤其是對研究某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定價值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCNA可反映垂體腺瘤細胞的增殖活性。在本研究的Western blot結(jié)果中，垂體前葉轉(zhuǎn)染腺病毒載體后，細胞內(nèi)PCNA的表達亦顯著增強，與pCREB的表達變化一致。在本研究中PCNA的表達增加是否是因為pCREB上調(diào)所致尚需進一步證明。

綜上所述，本研究表明雖然重組腺病毒載體可以被有效地應(yīng)用于垂體細胞的基因轉(zhuǎn)染中，但本身也會通過上調(diào)pCREB、PCNA蛋白的表達，在一定程度上改變催乳素細胞的增殖狀態(tài)，這一結(jié)果為闡明腺病毒載體和內(nèi)分泌細胞之間的相互作用及指導(dǎo)腺病毒載體的成功應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

［1］Castro MG，Goya RG，Sosa YE，et al.Expression of transgenes in normal and neoplastic anterior pituitary cells using recombinant adenoviruses：long term expression，cell cycle dependency，and effects on hormone secretion［J］.Endocrinology，1997，138（5）：2184-2194.

［2］Alesci S，Ramsey WJ，Bornstein SR，et al.Adenoviral vectors can impair adrenocortical steroidogenesis：clinical implications for natural infectionsandgenetherapy［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2002，99（11）：7484-7489.

［3］Smith-Arica JR，Williams JC，Stone D，et al.Switching on and off transgene expression within lactotrophic cells in the anterior pituitary gland in vivo［J］.Endocrinology，2001，42（6）：2521-2532.

［4］Lee EJ，Rachel W，Kotlar T，et al.Restoration of growth hormonereleasing hormone（GHRH）responsiveness in pituitary GH3 cells by adenovirus-directed expression of the human GHRH receptor［J］.Endocrinology，2001，142（1）：414-420.

［5］Ishida M，Takahashi W，Itoh S，et al.Estrogen actions on lactotroph proliferation are independent of a paracrine interaction with other pituitarycelltypes：astudyusinglactotrophenrichedcells［J］.Endocrinology，2007，148（7）：3131-3139.

［6］Kawashima K，Yamakawa K，Takahashi W，et al.The estrogenoccupied estrogen receptor functions as a negative regulator to inhibit cell proliferation induced by insulin/IGF-1：a cell context-specific antimitogenic action of estradiol on rat lactotrophs in culture［J］.Endocrinology，2002，143（7）：2750-2758.

［7］Ishida M，Mitsui T，Yamakawa K，et al.Involvement of cyclic adenosine 3'，5'-monophosphate response element-binding protein in the regulation of cell proliferation and the prolactin promoter of lactotrophs in primary culture［J］.Am J Physiol，2007，293（6）：E1529-E1537.

［8］Grady GC，Mason SM，Stephen J，et al.Cyclic adenosine 5'-monophosphate response element binding protein plays a central role in mediating proliferation and differentiation downstream of the pre-TCR complex in developing thymocytes［J］.J Immunol，2004，173（3）：1802-1810.

［9］Tokunou T，Ichiki T，Takeda K，et al.cAMP response elementbinding protein mediates thrombin-induced proliferation of vascular smoothmusclecells［J］.ArteriosclerThrombVascBiol，2001，21（11）：1764-1769.

［10］Mayr B，Montminy M.Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependentfactorCREB［J］.NatRevMolCellBiol，2001，2（8）：599-609.

［11］Dworkin S，Mantamadiotis T.Targeting CREB signalling in neurogenesis［J］.Expert Opin Ther Targets，2010，14（8）：869-879.