陳晨，王麗波，曹麗華，邢雪莎，王述森，麻宏偉，羅陽(yáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001；2.附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科，沈陽(yáng) 110004）

低磷酸酶血癥（hypophosphatasia）是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，以骨骼和牙齒礦化缺陷，血清和骨堿性磷酸酶活性持續(xù)低水平或缺如為主要特征。目前對(duì)本病尚無(wú)有效的治療方法。低磷酸酶血癥是由于肝/骨/腎堿性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL；MIM#171760） 突變所致，ALPL基因定位于1p36.1［1］，編碼的蛋白是組織非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）。該病的遺傳方式較為復(fù)雜，呈常染色體顯性或隱性遺傳。本研究采集了一個(gè)低磷酸酶血癥家系中1例低磷酸酶血癥的患兒及其患病母親的血樣，采用PCR結(jié)合基因測(cè)序的方法尋找患者及其母親的ALPL基因突變位點(diǎn)，進(jìn)一步確認(rèn)臨床診斷，同時(shí)探討患者發(fā)病的機(jī)制。

到漢武帝劉徹即位時(shí)，西漢儲(chǔ)備的糧食層層積壓，導(dǎo)致倉(cāng)庫(kù)爆棚；國(guó)庫(kù)里銅錢積壓太多，導(dǎo)致穿錢的繩子朽壞，銅錢散落無(wú)法計(jì)算。有錢就任性的劉徹，終于敢對(duì)匈奴人說(shuō)“不”了。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科提供家系成員外周靜脈血及病例資料，系譜圖見(jiàn)圖1。共采集到該家系中Ⅳ-1和Ⅲ-2兩名成員的血樣，先證者Ⅳ-1為2009年就診于盛京醫(yī)院的患者，男，3.5歲，以“腿彎3年”為主訴就診，Ⅲ-2為先證者母親。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查：查體發(fā)現(xiàn)先證者Ⅳ-1身高96.5 cm（-1SD），“O”型腿，雙膝間距5 cm。實(shí)驗(yàn)室檢查中Ⅳ-1血堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）95.5 U/L（參考值40~375 U/L），血鈣、磷、鎂、甲狀旁腺素水平均正常。X線檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)股骨頸干角變小，股骨頸略短，雙側(cè)髖內(nèi)翻，見(jiàn)圖2。Ⅲ-2的血ALP為19.5 U/L（參考值40~150 U/L），其他檢查結(jié)果正常。

2～5歲兒童的皮膚發(fā)育過(guò)程具有一定的特殊性，其皮膚含水比例高， 在不同環(huán)境中的水分喪失速度較快，同時(shí)皮膚層內(nèi)的脂質(zhì)含量偏低，容易受到自身免疫性因子或者外界病原體的感染而出現(xiàn)真皮層的病變[4]。2～5歲兒童的發(fā)病率在不同的年齡階段中處于較高水平[5-6]，部分東部沿海省份的相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，2～5歲兒童不同類型皮膚疾病的總體發(fā)病率占到了其年齡段的第一位[7]。而皮膚病對(duì)于2～5歲兒童具有下列幾個(gè)方面的主要影響[8-9]：①對(duì)于兒童自信心的培養(yǎng)具有較為顯著的影響，增加了患兒自卑或者遠(yuǎn)期抑郁及焦慮的風(fēng)險(xiǎn)；②導(dǎo)致患兒對(duì)于學(xué)習(xí)興趣的下降，影響到了其學(xué)習(xí)成績(jī)及自身性格的形成。

1.2.2 提取基因組DNA：取患者Ⅳ-1和Ⅲ-2枸櫞酸鈉抗凝處理的外周靜脈血各200μl，選用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（TaKaRa）試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃保存。

將患者Ⅳ-1的ALPL基因雙向測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行序列比對(duì)分析（Human BLAT Search，http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat），發(fā)現(xiàn)患兒第12外顯子存在一個(gè)雜合突變c.1366G>A（p.G456R），即cDNA第1 366位G突變?yōu)锳，導(dǎo)致456位的甘氨酸變?yōu)榫彼幔?jiàn)圖3。對(duì)患者母親ALPL基因第12外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示患者母親Ⅲ-2存在相同的雜合突變。

2 結(jié)果

1.2.3 PCR擴(kuò)增候選致病基因ALPL的外顯子并進(jìn)行測(cè)序分析：在UCSC網(wǎng)站獲得ALPL基因的DNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)覆蓋該基因編碼區(qū)（包括外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)）的引物，引物序列見(jiàn)表1。首先對(duì)先證者Ⅳ-1進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增該基因的 12個(gè)外顯子，PCR反應(yīng)體系為 2×GC Buffer I （Mg2+Plus）25 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）8 μl，上下游引物終濃度為 0.5 μmol/L，TaKaRa LA Taq 2.5 U，基因組 DNA約 200 ng，加ddH2O至50μl，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠純化后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果利用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)得的DNA序列進(jìn)行核酸序列的同源性比對(duì)分析。在先證者基因水平檢測(cè)到突變后，同樣通過(guò)測(cè)序分析方法驗(yàn)證家系內(nèi)其他患者是否存在相同位點(diǎn)的基因突變。

3 討論

低磷酸酶血癥是一種以骨礦化缺陷和組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）活性減低為主要特征的遺傳性疾病，目前尚無(wú)根治方法，雖然有報(bào)道可以用自體間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因替代治療［2］，但有效率和安全性尚待確定，因此基因診斷和遺傳咨詢顯得更為重要。低磷酸酶血癥致病基因ALPL定位于1p36.1，共包含12個(gè)外顯子，編碼524個(gè)氨基酸。參照人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Gene Mutation Database，HGMD）和國(guó)外學(xué)者建立的低磷酸酶血癥基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），到目前為止共報(bào)道了ALPL基因的218個(gè)突變，絕大部分為錯(cuò)義突變，大約占79.3%，且突變主要集中在第5~6外顯子和第9~12外顯子。本研究中檢測(cè)到的該家系的p.G456R的雜合突變，位于第12外顯子，Ozono等［3］曾經(jīng)報(bào)道過(guò)該突變并對(duì)其進(jìn)行體外重組實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示p.G456R突變體導(dǎo)致堿性磷酸酶完全失去活性。

在蔡家堡鄉(xiāng)、西山鄉(xiāng)、東山等鄉(xiāng)鎮(zhèn)建立馬鈴薯“青薯2號(hào)”“青薯9號(hào)”全膜覆蓋栽培技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)80hm2，平均產(chǎn)量3.58×104kg，總產(chǎn)量達(dá)286.4×104kg；實(shí)現(xiàn)收入3.22萬(wàn)元·hm-2，總產(chǎn)值257.76萬(wàn)元(按0.9元/kg計(jì)算)；與露地常規(guī)栽培相比，增產(chǎn)0.85×104kg，增產(chǎn)率31.14%，增收0.77萬(wàn)元·hm-2；新增產(chǎn)量68.0×104kg，新增產(chǎn)值61.2萬(wàn)元。

ALPL基因編碼的TNAP蛋白共分為4個(gè)功能區(qū)域，分別是冠區(qū)、酶激活位點(diǎn)、同源二聚體界面和鈣結(jié)合位點(diǎn)，該蛋白通過(guò)形成同源二聚體而發(fā)揮活性。第456位的氨基酸靠近TNAP的同源二聚體界面，并且在哺乳動(dòng)物中是十分保守的氨基酸，該位點(diǎn)由極性疏水性的甘氨酸變?yōu)閴A性的精氨酸，很可能影響TNAP的蛋白結(jié)構(gòu)和活性，因此初步認(rèn)為p.G456R是該家系中患者疾病表型的關(guān)鍵影響因素。根據(jù)患者Ⅳ-1和Ⅲ-2的年齡和生化檢查等臨床表現(xiàn)，兩者在臨床表型上都屬于輕型，輕型低磷酸酶血癥可呈常染色體顯性或隱性遺傳。而在該家系中，根據(jù)系譜圖可知，疾病在該家系中呈常染色體顯性遺傳，這與患者測(cè)序分析只檢測(cè)到一個(gè)雜合基因突變的結(jié)果吻合。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)到一個(gè)突變等位基因的輕型低磷酸酶血癥患者多是（76.6%）由于雜合突變的顯性負(fù)效應(yīng)致?。?~6］，而本研究中的p.G456R接近TNAP蛋白同源二聚體界面，因此推斷本家系更可能是由于雜合突變的顯性負(fù)效應(yīng)，即影響了正常二聚體的形成而致病，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表1 擴(kuò)增ALPL基因外顯子的引物序列Tab.1 Primer sequence of ALPL gene exons

本研究在中國(guó)人群中首次報(bào)道了一個(gè)低磷酸酶血癥家系A(chǔ)LPL基因編碼區(qū)的雜合錯(cuò)義突變c.1366G>A，進(jìn)一步豐富了基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，有助于深入了解該基因的結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)也確認(rèn)了患者的臨床診斷，為該家庭的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了可靠的依據(jù)。

［1］Mornet E.Hypophosphatasia［J］.Orphanet JRare Dis，2007，2：40-47.

［2］Katsube Y，Kotobuki N，Tadokoro M，et al.Restoration of cellular function of mesenchymal stem cells from a hypophosphatasia patient［J］.Gene Ther，2010，17（4）：494-502.

［3］Ozono K，Yamagata M，Michigami T，et al.Identification of novel missense mutations（Phe310Leu and Gly439Arg）in a neonatal case ofhypophosphatasia［J］.JClin Endocrinol Metab，1996，81（12）：4458-4461.

［4］Delphine F，Isabelle B，Anne-Sophie L，et al.Mild forms of hypophosphatasia mostly result from dominant negative effect of severe allelesor fromcompound heterozygosity for severeand moderatealleles［J］.BMCMed Genet，2009，6（10）：51-59.

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