楊大春 馬雙陶 楊永健 譚 艷 唐 兵 李 德 張 鑫 朱 峻 陳勁松

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科,四川成都 610083)

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是核受體超家族中的一類配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子,包括PPARα、δ和 γ3種亞型。PPARδ不僅在細胞生長、分化及組織損傷、修復過程中起重要作用,還參與脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運及胰島素信號調(diào)節(jié)作用[1]。大量的實驗表明,PPARδ與脂質(zhì)代謝有關,可糾正胰島素抵抗和高胰島素血癥。最近還發(fā)現(xiàn)PPARδ可以調(diào)節(jié)血管炎性反應,從而可能影響動脈粥樣硬化的發(fā)病過程[2]。但是,PPARδ通過何種機制影響動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展尚不十分清楚。本研究通過觀察PPARδ在急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)患者周圍血單核細胞的表達及其與血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-ase-9,MMP-9)及白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的關系,探討PPARδ在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2008年9月—2009年8月在我院心血管內(nèi)科住院的急性冠脈綜合征患者52例,發(fā)病至入院時間在12 h以內(nèi);其中急性心肌梗死(AMI)29例,不穩(wěn)定型心絞痛患者(UAP)23例;男性38例,女性14例,平均年齡58.9±9.7歲。46例健康對照組的患者為同期門診健康體檢者,其中,男性33例,女性13例,平均年齡 56.7±11.4歲。所有患者知情同意于入院時采取肘靜脈血分離單核細胞及分離血清,空腹12 h后于次日采血測血脂、血糖等。

除外合并以下疾病者:感染、腫瘤、全身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、嚴重高血壓病而血壓未能控制在理想值者、糖尿病及用非固醇類消炎鎮(zhèn)痛藥及免疫抑制藥者。

1.2 方法

1.2.1 材料 淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司,TRIzol TM 試劑盒(Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)、PCRmarker(北京天根生化科技有限公司),PCR擴增引物:GAPDH上游引物5′-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3′,下游引物 5′-GCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′(PCR 產(chǎn)物 824 bp);PPARδ 上 游 引 物 5′-TGAGTTCGCCAAGAGC-3′,下 游 引 物 5′-GCCAAGATCACAGGGAC-3′(PCR產(chǎn)物418 bp),由上海博亞生物技術(shù)公司合成。MMP-9試劑盒(Amersham Biosciences公司)、IL-10 ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。

1.2.2 外周血單核細胞分離 采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離周圍血單核細胞。取肘靜脈血5 mL加入肝素抗凝管,Hanks液1∶1稀釋混勻。將混勻后的血標本沿試管壁緩慢加入含1.5 mL淋巴細胞分離液的EP管內(nèi),室溫下2 500 r?min-1離心15 min。細胞分為上中下3層,在上層與中層分界處有一戒指狀白色細胞環(huán),為單核細胞層,吸出單核細胞層。將細胞濃度調(diào)至3×106個?mL-1,用于提取細胞RNA。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測PPARδ的表達 收集單核細胞,應用Trizol試劑盒提取細胞總 RNA,核酸蛋白定量儀測定 RNA含量,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,PPARδ及GAPDH PCR反應條件均為:95℃預變性5 min,94℃變性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸40 s,重復35個循環(huán),72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)對條帶掃描,軟件分析,分別計算PPARδ與GAPDH吸光度A的比值。

1.2.4 血脂、血糖的測定 采用全自動生化分析儀測定血脂、血糖。

1.2.5 MMP-9、IL-10的檢測 MMP-9及 IL-10測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5行統(tǒng)計分析,計量資料以ˉx±s表示,組間比較用 t檢驗,相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 急性冠脈綜合征組(ACS)和健康對照組的一般臨床資料見表1。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血糖值無顯著差異。

表1 兩組患者臨床一般情況比較

2.2 兩組患者血清中 MMP-9、IL-10的情況ACS患者血清MMP-9水平明顯高于健康對照組,IL-10明顯低于健康對照組,P＜0.01,見表2。

表2 兩組患者血清MMP-9及IL-10水平

2.3 周圍血單核細胞中PPARδ的表達 周圍血單核細胞RT-PCR檢測PPARδ表達結(jié)果見圖1,可見PPARδ在周圍血單核細胞中有表達,ACS患者PPARδ的表達(0.13±0.08)明顯低于健康對照組(0.34±0.09),P＜0.01。

圖1 健康對照組及ACS組患者周圍血單核細胞單核細胞PPARδ的表達比較(1,3,5為健康對照組,2,4,6為ACS組)

2.4 周圍血單核細胞PPARδ表達與血清MMP-9、IL-10的相關性 分別對ACS外周血單核細胞PPARδ表達水平和血清MMP-9及IL-10進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞PPARδ表達水平與MMP-9成負相關(r=-0.421,P＜0.05),與 IL-10成正相關(r=0.637,P＜0.05),見表3。

表 3 ACS患者周圍血單核細胞 PPARδ表達與血清 MMP-9、IL-10的相關性分析

3 討 論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種血管壁的病變,目前研究表明其發(fā)生除了與內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)向內(nèi)皮下轉(zhuǎn)移并沉積、泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞增殖等因素有關外,局部炎性反應在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)在AS斑塊周圍,存在大量炎性細胞浸潤,如巨噬細胞、淋巴細胞,同時有大量炎性介質(zhì)的異常表達,如C-反應蛋白、白介素-6、白介素-8及基質(zhì)金屬蛋白酶等。目前認為ACS發(fā)生的主要機制是由于冠狀動脈斑塊的不穩(wěn)定、破裂、出血、血栓形成,導致急性血流減少或中斷。

冠狀動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的降解容易導致斑塊破裂,在ACS的發(fā)病機制中起著重要作用,而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解斑塊局部細胞外基質(zhì)動脈內(nèi)膜細胞基質(zhì)(ECM)從而使纖維帽變薄,導致斑塊的不穩(wěn)定及破裂[5]。MMPs是一類生物活性依賴于鋅離子、有降解細胞外基質(zhì)能力的酶系家族,至今已識別的超過20余種。MMPs根據(jù)其功能將其分為幾大類:膠原酶、間質(zhì)溶解素、明膠酶、膜型金屬蛋白酶。MMP-9屬于 MMPs,主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠、纖維連接蛋白等,通過斑塊纖維帽的降解及破裂參與ACS的發(fā)病過程。有研究發(fā)現(xiàn),ACS患者周圍靜脈血MMP-9水平明顯增高,且經(jīng)內(nèi)科治療癥狀穩(wěn)定后其水平下降,說明MMP-9可能與斑塊的不穩(wěn)定性有關系[6]。本研究發(fā)現(xiàn),急性冠脈綜合征患者血清MMP-9明顯高于對照組,也進一步證實MMP-9參與了動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成。

在動脈粥樣硬化過程中,不僅有炎性介質(zhì)的異常表達,同時,體內(nèi)具有拮抗炎性作用的細胞因子,在AS斑塊局部抗炎因子存在異常表達。IL-10是具有潛在抗炎作用的細胞因子,它可以抑制多種細胞反應及細胞凋亡,而這些細胞反應對AS斑塊的發(fā)展、破裂及血栓形成起著重要作用[7]。IL-10是由激活的淋巴細胞、單核/巨噬細胞和肥大細胞產(chǎn)生的,它有多種抗炎性能:抑制轉(zhuǎn)錄因子核因子κB,進而抑制細胞因子、趨化因子的產(chǎn)生;抑制細胞黏附分子產(chǎn)生;抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌,刺激基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑生成;抑制組織因子及纖維蛋白原的表達,防止血栓形成,在抑制ACS的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[8]。本研究顯示,ACS患者血清中IL-10水平明顯低于對照組,提示在不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展過程中,抗炎因子的拮抗作用減弱可能也是其機制之一。表明致炎作用與抗炎作用的失衡可能是不穩(wěn)定斑塊的形成的重要原因。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬Ⅱ型核受體超家族成員之一。機體內(nèi)存在3種過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)亞型 ,即 PPAR-γ,PPAR-α和 PPAR-δ(也稱為PPAR-β),組成了核受體亞家族。PPARs與視黃酸X受體(RXR)結(jié)合形成異二聚體,與PPARs反應元件(peroxisome proliferator responsive element,PPRE)結(jié)合后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮一系列生物學效應[9]。既往研究發(fā)現(xiàn),PPARs 3種受體亞型都具有抗血管壁炎性反應的作用[1]。在與動脈粥樣硬化相關的脂質(zhì)代謝研究中,有研究發(fā)現(xiàn)PPARδ的激動劑GW501516在人巨噬細胞系(THP21)、皮膚成纖維細胞(IBR3N)、腸細胞(FHS74)中能促進膽固醇轉(zhuǎn)運;在鼠與非人靈長類能夠提高膽固醇逆向轉(zhuǎn)運子ACBA1(ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子),促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運,升高循環(huán)中的高密度脂蛋白(HDL)水平[10],減少具有致動脈粥樣硬化的小而密的 LDL的作用[11]。Graham等[12]給予LDLR/小鼠高脂飲食,同時分別給予PPARδ特異的激動劑GW610742或藥物載體,GW610742處理組動脈粥樣斑塊損傷面積減少達50%。但激動劑對血漿脂蛋白組成影響很小。GW610742處理組主動脈的炎性分子如MCP-1、TNF-α、ICAM-1表達下調(diào),腹膜單核巨噬細胞CD36、TNF-α表達也下調(diào)。血漿中炎性因子如 MCP-1、RANTES、IL-12和TNF-α的水平降低。Barish[13]研究發(fā)現(xiàn),PPARδ可通過誘導G蛋白信號基因調(diào)節(jié)子(RGS)的表達,抑制趨化因子的信號轉(zhuǎn)導,從而抑制動脈粥樣硬化的形成。本研究發(fā)現(xiàn),ACS患者周圍血單核細胞PPARδmRNA表達明顯低于對照組,且其表達量與炎性介質(zhì)MMP-9成反比,與IL-10成正比。提示PPARδ可能通過抑制MMP-9的表達,促進IL-10的表達,調(diào)節(jié)抗炎因子與炎性介質(zhì)之間的比例,從而發(fā)揮抑制動脈粥樣不穩(wěn)定斑塊形成的作用。表明PPARδ在急性冠脈綜合征的發(fā)病中可能具有重要作用。

PPARδ通過何種機制調(diào)控炎性介質(zhì)與抗炎因子的表達及維持其正常比例,目前尚不清楚,有待研究。由于本研究樣本量較少,尚需進一步積累大樣本資料進行深入研究。

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