馬元華 鄭發(fā)壽 樊曉明 張友元

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院消化科,*病理科,上海 200540)

過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR-γ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬核激素受體超家族成員,在脂代謝和糖代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)PPAR-γ在多種腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌、胃癌、肺癌等)中表達(dá),其經(jīng) PPAR-γ的配體作用后能誘導(dǎo)上述細(xì)胞的分化和凋亡。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,對DNA的復(fù)制和細(xì)胞的增殖有重要作用,PCNA在增生細(xì)胞中的表達(dá)有明顯的周期性,是一個(gè)評價(jià)細(xì)胞增殖的較好的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過研究PPAR-γ、PCNA在不同類型大腸癌中表達(dá),探討其與大腸癌病理特征之間的關(guān)系,以及在大腸癌細(xì)胞增殖分化中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本研究56例大腸癌標(biāo)本均取自復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院普外科2004—2005年接受手術(shù)治療的患者,全部經(jīng)病理檢查確診,均帶有癌旁正常組織。其中男性31例,女性25例;年齡32～86歲,中位年齡61歲。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后立即取組織標(biāo)本,經(jīng)4%福爾馬林浸泡固定后,脫水、透明、浸蠟包埋,制成4μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟至水。免疫組織化學(xué)檢測采用En vision兩步法,一抗兔抗人PPAR-γ多抗購自武漢博士德生物工程有限公司,工作濃度為1:50;PCNA單抗購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,工作濃度為1:100;PBS代替一抗作陰性對照,37℃孵育2 h。充分洗滌后,滴加購自上海長島抗體診斷試劑公司的即用型羊抗鼠、兔的二抗試劑,37℃孵育30 min。然后用DAB顯色,以胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.3 計(jì)算方法 根據(jù)著色程度和區(qū)域大小作PPAR-γ半定量分析。著色程度分為4級:強(qiáng)(++)、中(+)、弱(±)和無著色(-)。著色區(qū)域也分為4級:0、＜30%、30～60%和＞60% 。以所有著色程度為“++”及染色范圍＞30%的癌組織為PPAR-γ高表達(dá),其余為低表達(dá)。

采用雙盲法隨機(jī)選取5個(gè)視野,在高倍鏡(×200)下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的 PCNA的陽性細(xì)胞數(shù),PCNA指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/1 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)等對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PPAR-γ在不同組織中的表達(dá) PPAR-γ在大腸癌組織中均有不同程度的表達(dá)。在大腸癌病理組織切片中,細(xì)胞核周圍和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。在癌旁正常大腸組織內(nèi)的陽性細(xì)胞主要是大腸腺細(xì)胞,正常大腸組織中的陽性細(xì)胞較少,只在零星的大腸腺組織內(nèi)才可見到。大腸癌組織中的陽性細(xì)胞主要是增生或惡變的大腸腺細(xì)胞,見圖1。癌旁正常黏膜組織的陽性率為21.4%,而大腸癌組織為69.6%,兩者有極顯著性差異(P＜0.001),見表1。

圖1 免疫組織化學(xué)示大腸癌PPAR-γ呈陽性,癌旁組織呈陰性(×100)

表1 PPAR-γ在不同組織中的表達(dá)(例)

2.2 PPAR-γ的表達(dá)與大腸癌病理特點(diǎn)的關(guān)系將56例大腸癌病例的切片分別按性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期進(jìn)行分組,比較各組中的PPAR-γ表達(dá)的差異,見表2。

表2 PPAR-γ的表達(dá)與大腸癌病理特點(diǎn)的關(guān)系

PPAR-γ臨床特點(diǎn) 例數(shù)高表達(dá) 低表達(dá) P值Dukes分期0.039 A+B 26 14 12 C+D 30 25 5淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.048 N0 22 12 10 N1+ 34 27 7浸潤程度0.030 T1+2 21 11 10 T3+4 35 28 7

2.3 PPAR-γ的表達(dá)與PCNA-指數(shù)顯著相關(guān)(P＜0.001)。PPAR-γ高表達(dá)的大腸癌組織,其PCNA指數(shù)亦顯著增加 見表3。

表3 PPAR-γ的表達(dá)與 PCNA-指數(shù)的關(guān)系

3 討 論

Isseman等[2]于1990年首先在老鼠身上發(fā)現(xiàn)PPAR。它可以作為許多疾病的治療靶點(diǎn),應(yīng)用于肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血癥、動脈硬化和腫瘤的防治和治療等。在體內(nèi),PPAR與配體結(jié)合而被激活后與維甲酸類受體X(RXR)或糖皮質(zhì)激素受體形成異二聚體 ,再與位于其上游的特異性DNA序列結(jié)合使靶基因活化,從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。PPAR還可通過干擾核因子κB(NF-κB),通過輔助因子的抑制作用以及影響蛋白質(zhì)間的相互作用干擾某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。PPAR存在 3個(gè)亞型(α、β和γ),其中PPAR-γ主要分布于脂肪組織、胃腸道及造血干細(xì)胞中,參與脂肪的形成和代謝、炎性反應(yīng)、細(xì)胞的分化和凋亡等生理或病理過程。PPAR-γ作為前列腺素和脂肪酸下游的轉(zhuǎn)錄介質(zhì),其激活可增加大腸中β-catenin的濃度,后者與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。

配體活化的PPAR-γ能抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞分化。Altiod等[4]認(rèn)為PPAR-γ通過下調(diào)PPA蛋白激酶,抑制細(xì)胞生長轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子E-F/DP而發(fā)揮作用。Schaefer等[5]則認(rèn)為PPAR-γ抑制劑可下調(diào)微管蛋白水平,從而抑制細(xì)胞周期循環(huán)及其凋亡,并促進(jìn)大腸癌細(xì)胞分化。PPAR-γ能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)。Su等[6]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞高表達(dá)PPAR-γ蛋白。本研究顯示 ,大腸癌組織中PPAR-γ的陽性率顯著高于癌旁正常黏膜組織,提示PPAR-γ的高表達(dá)可能是大腸癌發(fā)生的分子標(biāo)志。這與鐘蕓詩等[7]的研究結(jié)果相一致。他們證實(shí),PPAR-γ在人胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào) ,可能與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。本研究證實(shí)PPAR-γ的表達(dá)在大腸癌Dukes分期的“C+D”期顯著高于“A+B”期,且隨著病程的進(jìn)展,PPAR-γ的表達(dá)進(jìn)一步增高,其分化程度越低、惡性程度越高則PPAR-γ的表達(dá)就越高、越易被檢出,從而有可能為臨床療效觀察、病情檢測和預(yù)后判斷提供一個(gè)新的指標(biāo)。穿透漿膜層癌腫組織的PPAR-γ陽性率高于未穿透漿膜層者;在有淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移癌腫組織的PPAR-γ表達(dá)亦顯著高于相應(yīng)無轉(zhuǎn)移者。說明 PPAR-γ的高表達(dá)不僅與大腸癌的發(fā)生相關(guān) ,還與癌腫的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān) ,同時(shí)也預(yù)示了患者的不良預(yù)后。

有流行病學(xué)資料顯示進(jìn)食高脂肪食物與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān),而前者正是PPAR-γ的天然激動劑。給與C57BL/6J-APCMin/+鼠曲格列酮和羅格列酮,可分別使結(jié)腸癌的發(fā)生率增加4.25倍和1.83倍;并且可使腫瘤的體積增大。這與給與 C57BL/6JAPCMin/+鼠高脂飲食后的結(jié)果相似,可見高脂飲食可能就是通過PPAR-γ而導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生的[8]。

PCNA是一種分子量為33.36 KD的核蛋白,是細(xì)胞核合成DNA所必須。PCNA在DAN合成前G1末期升高,S期達(dá)到最大值,G2和M 期明顯下降。本研究結(jié)果顯示PPAR-γ高表達(dá)組的PCNA指數(shù)顯著高于低表達(dá)組,說明PPAR-γ促進(jìn)了大腸腫瘤細(xì)胞的增殖。而腫瘤細(xì)胞的增殖是其浸潤轉(zhuǎn)移的基本條件,這也證實(shí)PPAR-γ確實(shí)與大腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

1 Berthiaume M,Sell H,Lalonde J,et al.Actions of PPAR gamma agonism on adiposetissue remodeling,insulin sensitivity,and lipemia in absence of glucocorticoids[J].Am J Phy siol Regul Integr Comp Physiol,2004,287(5):1116-1123.

2 Isseman I,Green S.Activation a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators[J].Nature,1990,347:645-650.

3 Theodoropoulos G,Papaconstantinou I,Felek ouras E,et al.Relation between common polymorphismsin genes related to inflammatory response and colorectal cancer[J].World J Gastroenterol.2006,12(31):5037-5043.

4 Altiod S,Xu M,Spiegelman BM.PPARγinduces cell cycle withdrawal:inhibition of E2F/DP DNA-binding activity via down-regulation of PP2A[J].Genes Dev,1997,11(15):1987-1998.

5 Schaefer KL,Takahashi H,Morales VM,et al.PPARgamma inhibitors reduce tubulin protein levels by a PPARgamma,PPARdelta and proteasome-independent mechanism,resulting in cell cycle arrest,poptosis and reduced metastasis of colorectal carcinoma cells[J].Int J Cancer,2007,120(3):702-713.

6 Su CG,Wen X,Bailey ST,et al.A novel therapy for colitis utilizing PPAR-gamma ligands to inhibit theepithelial inflammatory response[J].J Clin Invest,1999,104(4):383-389.

7 鐘蕓詩,姚禮慶,孫益紅.過氧化物酶體增殖因子活化受體δ(PPARδ)在大腸腺癌、癌中的表達(dá)及其意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2004,11(6):1040-1042.

8 Saez E,Tontonoz P,Nelson MC,et al.Activators of the nuclear receptor PPARgamma enhance colon polyp formation[J].Nat Med,1998,4():1058-1061.