南春輝

摘要:自從1889年Tanret從燕麥麥角菌中分離到麥角甾醇以來,人們開始對麥角甾醇進行了大量的研究。麥角甾醇(ergostero1) 又稱麥角固醇,大量存在于酵母中,是一種重要的醫(yī)藥化工原料,可用于"可的松"、"黃體酮"等藥物的生產(chǎn)。麥角甾醇受9到紫外線照射時可轉(zhuǎn)化為維生素D2,是維生素D2的前身,也是生產(chǎn)甾體激素藥物的重要原料。本文對近十年來麥角甾醇的研究予以綜述,旨在為麥角甾醇的進一步應用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:麥角甾醇;生物合成

1 生物合成途徑

1.1麥角甾醇生物合成途徑

麥角甾醇的生物合成是一個多酶參與的復雜的代謝過程。近年來,人們對真核細胞內(nèi)麥角甾醇的生物合成做了大量的研究,對其生物合成途徑有了比較詳細的了解,其合成途徑如下:

ERG9→鯊烯ERG1→ 環(huán)氧鯊烯ERG7→羊毛甾醇ERG11→4,4-二甲基-膽甾-8,14, 24 三烯醇ERG24 →4,4-二甲基酵母甾醇ERG25→酵母甾醇ERG6→糞甾醇ERG2→ 上位甾醇ERG3→ 麥角-5,7,24 (28) 三烯醇ERG5→麥角-5,7,22,24 (28) 四烯醇ERG4→ 麥角甾醇 [1]

1.2麥角甾醇生物合成途徑有關(guān)基因的研究

ERG9 :ERG9 編碼的蛋白為鯊烯合成酶,催化2分子焦磷酸法呢酯形成麥角甾醇生物合成途徑中第一個固醇分子,是麥角甾醇合成的直接前提。有兩家實驗室克隆到了ERG9[2] ,在兩家的研究當中ERG9 的營養(yǎng)缺陷型需補充麥角甾醇和有氧生長條件,用含ERG9 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,導致大腸桿菌內(nèi)麥角甾醇的合成, ERG9 包含1個開閱框,編碼444個氨基酸的蛋白質(zhì),蛋白分子量為51700,該基因在人與酵母之間高度保守,位于第Ⅷ染色體上。

ERG1:ERG1 編碼產(chǎn)物為鯊烯環(huán)氧酶,該酶為需氧酶,催化鯊烯轉(zhuǎn)化為2. 3 環(huán)氧鯊烯,利用該酶對丙烯胺敏感的特性克隆到了ERG1 基因[3] ,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),ERG1 基因包含1個開閱框,編碼1個496氨基酸的蛋白質(zhì),位于第ⅩⅤ染色體上。

ERG7 :ERG7 編碼的蛋白產(chǎn)物為羊毛甾醇合成酶,先后在熱帶假絲酵母( C. albicans) 和啤酒酵母(S. cerevisiae) 中克隆到該基因[4], ERG7 包含1個2 196bp 的開閱框,編碼732 氨基酸的蛋白質(zhì)。ERG7 位于達到第Ⅷ染色體上。

ERG11 :ERG11 編碼產(chǎn)物為羊毛甾醇14α去甲基化酶-細胞色素P450 ,催化羊毛甾醇14α氧化脫甲基作用。Kalb 等從酵母中克隆到該基因[5],它含有單一的開閱框, 編碼530 氨基酸的蛋白質(zhì),ERG11 被破壞的菌株需補充麥角甾醇及有氧生長條件。目前已經(jīng)分別從高等植物、真菌、哺乳動物體內(nèi)克隆出P450 基因并測序分析, 所有的P450 都含有500～600 個氨基酸殘基,多序列聯(lián)配結(jié)果表明高等植物、真菌、哺乳動物之間有35 %～42 %的序列同源性,說明P450 是非常保守的,P450還是許多抗真菌劑的作用靶位,對P450 基因及其產(chǎn)物的研究將為抗真菌新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。ERG8 位于達到第Ⅷ染色體上。

ERG24 :ERG24 編碼的蛋白產(chǎn)物是C-14 還原酶,催化4. 4-二甲基-膽甾-8. 14. 24 三烯醇還原為4. 4-二甲基酵母甾醇。ERG24 包含1個1314bp 的開閱框,編碼438 氨基酸的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)分子量為50612[6] 。該基因在染色體上的位置尚未確定。

ERG25 :ERG25 編碼的蛋白產(chǎn)物為C24 固醇甲基氧化酶,M. Bard 等人首先在啤酒酵母中克隆到了該基因[7] , ERG25 突變體在菌體內(nèi)積累4. 4-二甲基酵母甾醇, ERG25 對于啤酒酵母生長是必需的。ERG25 包含單一開閱框,編碼309 氨基酸的蛋白質(zhì),存在于第Ⅶ染色體上。

ERG6 :ERG6 編碼的產(chǎn)物為C-24 甲基化酶,存在于植物和真菌中,催化酵母甾醇C-24 位甲基化形成28 碳的甾醇結(jié)構(gòu),C-24 位甲基化對形成正常細胞膜是必需的 , ERG6 突變體對放線菌酮敏感,對制霉菌素具抗性,對ERG6 突變體必需補充色氨酸。ERG6 具單一開閱框,編碼383 氨基酸的蛋白質(zhì),ERG6 定位在第ⅩⅢ染色體上。

ERG2 :ERG2 編碼的蛋白為C-8 固醇異構(gòu)酶,催化糞甾醇轉(zhuǎn)化為上位甾醇,該酶是抗真菌藥物嗎琳的作用靶位。基因包含單一開閱框,編碼222氨基酸的蛋白質(zhì)。ERG2 定位于第ⅩⅢ染色體上。

ERG3 :ERG3 編碼的蛋白產(chǎn)物為C-5 脫氫酶,催化上位甾醇還原為麥角-5. 7. 24 ( 28) 三烯醇。ERG3 存在于動物、植物、真菌中,包含單一開閱框,編碼365 個氨基酸的蛋白質(zhì)。ERG3 對S . cerevisiae 的生長是非必需的。ERG3 定位在第ⅩⅡ染色體上。

ERG5 :ERG5 編碼的蛋白產(chǎn)物為C-22 固醇脫氫酶,催化麥角-5. 7. 24 (28) 三烯醇還原為麥角-5.7. 22. 24 (28) 四烯醇。該酶是麥角甾醇生物合成過程中第二個細胞色素P450 超家族蛋白質(zhì)成員,與哺乳動物細胞色素P450 相似。ERG5 包含單一開閱框,編碼538 氨基酸的蛋白質(zhì),定位在第ⅩⅢ染色體上。

ERG4 :ERG4 編碼的蛋白產(chǎn)物為C-24 固醇還原酶,是麥角甾醇生物合成過程中最后一個酶,催化最終合成麥角甾醇,序列分析表明ERG4 與ERG24十分相似,有很高同源性 , ERG4 包含單一開閱框,編碼473 氨基酸的蛋白質(zhì),位于第Ⅶ染色體上。

2生產(chǎn)工藝

2.1酵母發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)麥角甾醇工藝流程:

玉米秸稈→粉碎→蒸汽爆破→纖維素(半纖維素)→稀酸水解→六碳糖(五碳糖) →發(fā)酵→離心→皂化→提取→濃縮→麥角甾醇結(jié)晶。

2.2葡萄糖母液生產(chǎn)高麥角甾醇工藝流程

試管斜面→搖瓶種子→小小種子罐→小種子罐→中種子罐→大種子罐→處理好的原料+種子→發(fā)酵→分離→洗滌→分離→洗滌→分離→壓棒→自溶→噴霧干燥→高麥角甾醇酵母粉→包裝 取樣化驗一成品

2.3 紅曲菌中提取麥角甾醇方法

篩選一株產(chǎn)麥角甾醇較高的紅曲菌,在28攝氏度時,以小米作為基質(zhì),加水量為60%,在攪拌水中加入酵母膏和鈣離子,發(fā)酵3天,可最大量產(chǎn)生麥角甾醇。

3分析方法

3.1通過單因素試驗和正交優(yōu)化試驗篩選由紅曲提取麥角甾醇的最佳條件。

利用HPLC檢測麥角甾醇的含量,確定利用三氯甲烷為溶劑,在浸提比為1:250(g/m1),反應溫度為50℃ 時,超聲波下抽提20min為最佳反應條件,每g干由可獲得9mg左右的麥角甾醇。

3.2建立高效液相色譜法測定冬蟲夏草中麥角甾醇的含量測定方法。

采用ODS-C18色譜柱,甲醇為流動相,檢測波長為282 nlTt,流速為1.3 ml/min。本法結(jié)果準確、簡便可行、分析速度快、分離效果好。適用于冬蟲夏草中麥角甾醇的含量測定。

3.3一種可準確、快速測定糧食中麥角甾醇含量的液相色譜方法。

樣品皂化后,用正己烷萃取麥角甾醇,不需要進一步純化,直接上液相色譜分析。分析柱為Spherisorb硅膠柱,檢測波長282 nm。方法的檢出限為0.1 mg/kg,方法的回收率在95.1% ～100.0% 。分析的準確度評價采用微量制備技術(shù)和反相液相色譜分離技術(shù),證明了該方法分析的結(jié)果準確可靠。

4應用

4.1通過對麥角甾醇生物合成途徑的研究,可以加入抗真菌藥作用靶酶,來抑制麥角甾醇的合成,以至于減少禾谷絲核菌的生成,增加小麥的產(chǎn)量。

4.2以麥角甾醇為原料, KMnO4 為氧化劑, 一步法氧化反應得到活性四羥基麥角甾醇ergosta-8 (9) ,22- diene-3 ,5 ,6 ,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22 E) 和ergosta-8(14) ,22- diene-3 ,5 ,6 ,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22 E) ,該反應操作和分離純化工藝簡單, 產(chǎn)率高。

4.3麥角甾醇是真菌類的特征甾醇,是一種重要的維生素D源。其含量測定曾采用薄層掃描法,步驟繁雜,耗時過多。國外有人測定麥角甾醇的含量作為糧食發(fā)霉的定量指標,操作復雜繁瑣。類似產(chǎn)品中麥角甾醇的含量測定多采用高效液相色譜法。本文將樣品直接皂化,用環(huán)己烷提取,用分配柱和吸附柱凈化和濃縮,用HPLC法測定其中麥角甾醇的含量,為控制其質(zhì)量提供了可靠而簡便的方法。

5展望

綜上所述, 麥角甾醇具有重要的生理作用, 是食品、飼料及醫(yī)藥工業(yè)原料。麥角甾醇工業(yè)化生產(chǎn),有兩個途徑微生物生物合成與化學合成。因甾體化合物分子含有不對稱中心, 合成步驟多, 難度大,國內(nèi)外廣泛開展微生物發(fā)酵合成麥角甾醇的研究。目前麥角甾醇生物合成途徑的研究取得了很大的進展,這將為通過基因工程手段獲得高產(chǎn)麥角甾醇菌株和抗真菌藥物設(shè)計提供理論指導,隨著基因表達調(diào)控研究的推進,將為合理設(shè)計培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)條件提供理論指導,從而構(gòu)建高產(chǎn)菌株,優(yōu)化培養(yǎng)條件,將會進一步提高麥角甾醇的產(chǎn)量。

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