盤 箐 李貝晶

[摘要]目的：探討制備動物免疫血清的方法和效果，以適應(yīng)其在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的需要。方法：制備好的免疫原，按照一定的免疫程序(免疫途徑、次數(shù)、間隔時間、劑量)接種給所選擇的動物。待動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體后，采集動物血液，分離血清對其效價進(jìn)行測定。結(jié)果：經(jīng)免疫后的抗血清最終分別達(dá)到1：2040以上的高效價。結(jié)論：此方法制備的抗血清效價高，特異性高，親和力強(qiáng)，既經(jīng)濟(jì)又方便，適用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，提高了實(shí)驗(yàn)的開出率。

[關(guān)鍵詞]免疫血清；免疫；免疫學(xué)試驗(yàn)；效價

[中圖分類號]R392.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]1674-4721(2009)12(b)-139-02

動物免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于臨床診斷、治療和預(yù)防中，為教學(xué)、科研、檢驗(yàn)之常用。在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)中，形象、直觀、簡易的直接凝集反應(yīng)有助于學(xué)生了解抗原、抗體及抗原抗體間的免疫反應(yīng)等抽象的概念，免疫血清的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性。因此，制備高質(zhì)量的免疫血清是建立高水平檢測方法的前提條件。但免疫血清的制備較復(fù)雜，且需學(xué)生動手操作，用量較大，為達(dá)到這一目的，除了具備理想的免疫原外，還需要選擇適宜的動物和設(shè)計有效可行的免疫程序或方案。通過多年的工作實(shí)踐，筆者制備了高效價、高特異性、高親和性的動物免疫血清，既經(jīng)濟(jì)又方便，供教學(xué)、科研所用，提高了實(shí)驗(yàn)的開出率。

1方法與結(jié)果

1.1動物的選擇及飼養(yǎng)

制備抗血清的動物主要是哺乳類和禽類。羊、馬、豚鼠、兔都是常用的動物，在實(shí)驗(yàn)中，選擇動物時應(yīng)考慮抗原與動物的種屬關(guān)系、抗原性質(zhì)與動物種類、免疫血清的需要量、要求以及動物個體等因素。因不同動物對同一抗原的敏感性不同，免疫時至少取用2只以上動物。選擇制備免疫血清的動物必須是適齡、健壯、無感染的正常動物，體重最好在2～3 kg，年齡6個月以上，因雌性動物在性周期的不同階段和懷孕、授乳時機(jī)體對抗原的敏感性有較大改變，所以一般挑取雄性動物。動物免疫后要認(rèn)真做好動物的編號、標(biāo)記、管理和記錄，本實(shí)驗(yàn)用的動物是健康家兔。

1.2抗原的制備

1.2.1抗原稀釋

用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg／ml，放置4℃過夜，次日取出，與佐劑混合制成乳劑后用于動物免疫。免疫原的注射劑量隨抗原的性質(zhì)有較大差異。一般考慮抗原的免疫原性的強(qiáng)弱、分子量大小、抗原的純度、有無毒性及動物個體狀態(tài)、免疫途徑和時間、佐劑的使用與否等。對于純的可溶性抗原，免疫時需與等量的弗氏完全佐劑混合，其免疫劑量以動物體重計算，一次注入的總劑量以0.5 mg／kg為宜。通常免為100～1000μg／次。另外免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可大量少次注射制備高度特異性的抗血清，選用低劑量抗原短程免疫法。

免疫周期隨抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐劑而變化。單次注射抗體產(chǎn)生緩慢，效價低，維持時間短，但抗體特異性高；多次注射無以上缺點(diǎn)，但抗體特異性有所降低，一般以3～4次較合適。注射間隔時間一般以1～2周為宜。間隔時間短，起不到再次免疫的作用；太長，則免疫過程延長，從而影響血清的特異性，如無佐劑時間隔2～4d，加用佐劑時可間隔10～30d。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周，此后，每次加強(qiáng)免疫的間隔時間為2～3周。

1.2.2佐劑和抗原乳劑的配制

1.2.2.1佐劑的配制。弗氏完全佐劑，各實(shí)驗(yàn)室的配方不盡相同，我室采用的配方如下：醫(yī)用液體石臘20 ml與羊毛脂12g混勻加熱溶化，分裝于青霉素小瓶，用紗布、線繩扎緊瓶塞。高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ诿庖咔皽?zhǔn)備抗原乳劑制備時，以活卡介苗代替死結(jié)核菌，每毫升試劑中加入10mg活卡介苗，即為弗氏完全佐劑。

1.2.2.2抗原乳劑的制備。本實(shí)驗(yàn)選用注射器推注法：將抗原溶液和等量的完全佐劑(注意佐劑必須先加熱融化。不超過50℃)分別吸入兩個5 ml注射器內(nèi)，在兩個注射器的12號針頭間用一根長約8-12 cm的醫(yī)用無毒塑料管。將兩個注射器連接在一起(塑料管必須浸泡消毒與注射器針頭相連接)。針頭插進(jìn)塑料管1～2 cm然后兩人相對而坐。緩緩?fù)苿俞標(biāo)ǎ构軆?nèi)溶液進(jìn)入塑料管道至對側(cè)注射器內(nèi)，每次必須把管內(nèi)容物全部推出，另一側(cè)同樣操作，使管內(nèi)液體往返混合直至形成油包水乳劑為止。

制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此，必須進(jìn)行質(zhì)量檢查。檢查的方法：將制成的乳劑滴在涼的自來水表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面保持乳滴珠完整而不分散；如進(jìn)入水面后立即擴(kuò)散，水面油花逐漸擴(kuò)大即不合格，應(yīng)繼續(xù)乳化至合格為止。

1.3免疫途徑、注射時間、部位及劑量

不同的免疫途徑，抗原在體內(nèi)的的代謝速度不同，對免疫系統(tǒng)的刺激強(qiáng)弱也就不同，因而產(chǎn)生抗體的水平也就不同?？乖淖⑸渫緩娇筛鶕?jù)免疫動物個體的大小、抗原及抗體制備目的或要求不同，選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈或腹腔等不同途徑免疫。本實(shí)驗(yàn)對家兔使用皮內(nèi)和皮下多點(diǎn)注射。第1周在足、掌皮內(nèi)注射含佐劑抗原0.1ml，第2周在腹部皮下注射含佐劑抗原0.5 ml，第3周在腹部皮下注射不含佐劑抗原0.5 ml，第4周在腹部皮下注射不含佐劑抗原0.5 ml。

1.4試血及測定抗體效價

末次注射10 d后于耳靜脈采血2 ml，分離血清進(jìn)行試血。筆者選用免疫雙擴(kuò)散法在56℃條件下加熱30 min滅活補(bǔ)體。在瓊脂板中間孔加稀釋的抗原10μl( mg／ml)，周圍孔依順時針方向，分別加入用生理鹽水或PBS按1：2，1：4，1：8，1：16，1：32和1：64的比例稀釋的動物免疫血清。經(jīng)37℃保溫24 h后觀察結(jié)果，效價在1：16以上即可決定采血。選用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)將一定濃度的抗原200μl加入到環(huán)狀沉淀管中，然后在抗原液面上加入稀釋的免疫血清，如在20 min內(nèi)，抗原與血清的交界面能出現(xiàn)“++”的沉淀環(huán)，以沉淀環(huán)的直徑、大小來判斷效價的高低。一般效價高達(dá)1：2040以上才可放血。

1.5取血、分離、分裝及保存

免疫動物經(jīng)效價檢測合格后即可考慮取血。為減少血清中的脂肪含量，放血前可考慮停食12 h。本實(shí)驗(yàn)采用心臟穿刺取血，無菌技術(shù)進(jìn)行操作，動物于仰臥位固定，用食指探明心臟博動量高部位，剪去少許毛。用2.5％碘酒和75％酒精消毒后，以9號針頭在預(yù)定位置與胸部呈45。角刺入心臟，微微上下移動針頭，待血液進(jìn)入針筒后，即將注射器位置固定取血。2.5kg體重的家兔一次可取血20～30ml。取血后由靜脈緩緩注入等量5％葡萄糖液以補(bǔ)足失血量。取血的兔子經(jīng)2～3個月休息?？稍俅渭訌?qiáng)免疫后取血。

1.6分離血清及免疫血清的保存

無菌條件下將平皿或三角瓶內(nèi)的血液凝固血塊收縮后，用無菌滴管吸取血清，于3 000 rpm離心15 min。取上清液。合格后的抗血清以1：100比例加入1％的硫柳汞或5％的疊氮鈉，最后濃度分別為0.01％或0.05％，用無菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝1ml左右。-20℃以下保存，可保存2年以上。如有條件可將血清冷凍干燥保存于4℃以下冰箱。保存時間更久。

2討論

此方法簡單易行，速度快，效果好，所獲的抗體效價高，特異性高，親和力強(qiáng)。通過本次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果來看，整個實(shí)驗(yàn)過程的操作簡單易行，效果高，更重要的是本實(shí)驗(yàn)包含了抗原的制備、免疫動物、抗血清的采集、抗體的鑒定、分離提純、抗體的效價檢測等內(nèi)容。是一項綜合性系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)，是免疫學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)的濃縮。該實(shí)驗(yàn)既提高了學(xué)生的理論水平，又培養(yǎng)了學(xué)生運(yùn)用理論指導(dǎo)實(shí)踐，在實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。因此，筆者認(rèn)為這種系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)適合免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。