EffctmonitoringofZhitongJianguFormulainpreventionandtreatmentofarticularcartilagesenescenceinrabbit knee osteoarthritis by T₂ mapping

GAOHui’，LI Fangli2，YAN Luyoul，ZHANG Kun1.3

'DepartmentofRadiology，F(xiàn)irst HospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410o7，China;Departentof Radiology，Second People's Hospital ofHunan Province，Changsha 4looo7，China; ³ Collegeof Integrated Traditional Chineseand Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 41o2o8，China.

[Abstract]Objective：Toevaluatethe therapeuticefectof Zhitong JianguFormula（ZTJGF）inpreventingandtreating the senescence of articular cartilage in knee osteoarthritis（KOA），and to explore the value of T₂ mapping in monitoring the therapeuticeffect.Methods：AKOAmodelinNewZealandwhiterabitswasproducedbyimmobilizingthekneejointin plasterbandageinfullextension.Acordingtodiferenttreatmentmethods，32NewZealandwhiterabbitswererandomly dividedintothenormalcontrolgroup，themodelcontrolgroup，theZTJGFtreatmentgroup，andtheglucosaminesulfate treatmentgroup，with8rabbitsineachgroup.Aftertwoweeksofimmobilizing，thenormalcontrolgroupandthemodel controlgroupweregiventhesamevolumeof distiledwaterbygavage，whilethe ZTJGF treatmentgroup wasgiven ZTJGF，andtheglucosaminesulfatetreatmentgroupwasgivensulfuricacidandglucosecapsules.After4weeksoftreatment， knee T2mapping was performed on all groups，and the expression of p16^mK4a inarticular chondrocytes wasanalyzed by immunohistochemistry.The diferencesinTvaluesof articularcartilageand p16^mK4a expression among the four groups were compared.The correlationsamong different intervention methods ，T₂ values and p16^uN×4a expression were analyzed. Results ： T₂ valueintheZTJGFtreatmentgroupandtheglucosaminesulfategroup werehigherthanthatinthenormalcontrol group， but lower than thatin the model control group（all Plt;0.05 ）. The p16^uNK4a expression in the ZTJGF treatment group，the glucosamine sulfate group and the normal control group had no differences（ P gt;0.05），but were significantly lower than that in

the model control group（all Plt;0.05 ）.p16 INK4a expression wasnonlinearly related to T₂ value and was slowly increased and then rapidly increased as the T₂ value increased（ Plt; 0.05）．Conclusions：The ZTJGF can prevent and treat the aging of articular cartilage in KOA，and Tmapping can be usedasa non-invasive assessment tool for prevention of cartilage senescence.

[Keywords] Osteoarthritis ；Articular cartilage;Zhitong Jiangu Formula;Magnetic resonance imaging;p16INK4a

骨關節(jié)炎是一種常見的慢性非炎癥性骨關節(jié)疾病，可引起滑膜關節(jié)的結構損傷和功能障礙，是成人疼痛和致殘的主要病因，給家庭及社會帶來沉重的負擔[1-2]。關節(jié)軟骨退變是骨關節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展的重要因素；而在微觀水平上，軟骨細胞的衰老參與骨關節(jié)炎的病理生理過程[3]，其中 p16^INK4a 是衡量軟骨細胞衰老的指標[4-5]。止痛健骨方通絡止痛、活血祛痰、強筋健骨，對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨損傷具有療效[6。目前評估關節(jié)軟骨的手段非常多，其中 T₂ mapping成像技術是臨床上定量分析關節(jié)軟骨的無創(chuàng)手段之一，能反映微觀水平上軟骨基質(zhì)中膠原纖維和水分子含量等生化成分并進行定量分析7]，既可作為膝關節(jié)軟骨損傷早期診斷的可靠依據(jù)，也可作為評估止痛健骨方治療骨關節(jié)炎療效的手段。本研究旨在通過 T₂ mapping成像技術評價止痛健骨方在防治膝骨關節(jié)炎軟骨衰老上的可行性，并闡明關節(jié)軟骨細胞 p16^INK4a 表達量與定量T值的相關性。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級的新西蘭大白兔32只，雌雄各半，體質(zhì)量約 2.2kg ，動物許可證號為SCXK（湘）2015-0008。32只兔適應性喂養(yǎng)1周后隨機分成4組：正常對照組、模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組，每組8只，單籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食水，且保持 12h 晝夜輪替及恒溫環(huán)境。本研究經(jīng)省中醫(yī)藥研究院倫理委員會批準（批號：2017-0021）。

1.2 實驗方法

模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組采用改良伸直位制動法制作膝骨關節(jié)炎模型，制動6周[8]。止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組制動2周后開始灌胃。止痛健骨方組給予止痛健骨方：當歸 12g ，黃芪 9g ，白芥子（炒） 12g ，鹿角霜 7.5g ，丹參10.5g ，豬牙皂 1.5g ，鱉甲 7.5g ，乳香（醋制） 7.5g ，沒藥（醋制） 7.5g ，獨活 3Δg ，千年健 9g ，陸英 9g ；依據(jù)臨床研究批件規(guī)定的制劑工藝及質(zhì)量監(jiān)測標準用以上12味藥生產(chǎn)干膏粉以備實驗，生藥量 0.298g/mL 給藥量 10mL?kg^-1?d^-1 （前期藥效學實驗確定的最佳劑量濃度）。硫酸氨基葡萄糖組給予硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業(yè)，產(chǎn)品批號：GSCy1008），劑量 0.088g?kg^-1?d^-1 （根據(jù)人與兔等效劑量公式折算，相當于1倍臨床等效劑量），每日1次，連續(xù)4周。正常對照組和模型對照組僅同期灌以相同容積的蒸餾水。

1.3 MRI檢查及圖像處理

灌胃治療4周后均行MRI掃描。采用GE SignaHDxt 3.0T MRI系統(tǒng)、膝關節(jié)線圈行兔右后膝關節(jié)成像。經(jīng)耳緣靜脈注射 3% 的戊巴比妥鈉溶液，劑量30mg/kg 體質(zhì)量，動物麻醉后固定雙膝，并取仰臥位、腿先進。采用冠狀位及矢狀位脂肪抑制FSE-PDWI：TR 1500ms ，TE 30ms ，視野 16cm×16cm ，層厚3mm ，層距 1mm ，矩陣 256×256 ；矢狀位多回波自旋回波 T₂ mapping序列：TR 1100ms ，TE取9、18、27、36、45、54、63、72ms ，視野 16cm×16cm ，層厚 3mm ，層距 1mm ，矩陣 256×256 。

將圖像傳至GE后處理工作站，運用Functool軟件進行后處理，并得到 T₂ mapping偽彩圖，根據(jù)冠狀位和矢狀位PDWI三維定位，同時參考大體病理軟骨病變區(qū)域確定所需測量的區(qū)域，每個區(qū)域設置ROI（圖1），重復測量3次后取平均值作為最終結果。設置ROI時需避開周圍的非軟骨區(qū)域，并使ROI的形狀和大小一致。

圖1MRI T₂ mapping上股骨內(nèi)側骨損傷關節(jié)軟骨ROI的勾畫示意圖注：根據(jù)大體標本確定股骨內(nèi)側骨關節(jié)軟骨損傷最嚴重的區(qū)域，測量該區(qū)域至股骨內(nèi)側髁外緣的距離，在冠狀位脂肪抑制PDWI（圖1a雙箭）上確定股骨內(nèi)側關節(jié)軟骨損傷最嚴重的區(qū)域（白色虛線），并在對應的矢狀位T₂ mapping偽彩圖（圖1b）上勾畫出股骨內(nèi)側骨前部關節(jié)軟骨的ROI（白色實線）

1.4病理學檢查

MRI掃描后 24h 內(nèi)，通過空氣栓塞處死所有實驗動物，暴露右膝關節(jié)，取膝關節(jié)股骨內(nèi)側髁，通過肉眼觀察股骨內(nèi)側髁區(qū)，確定關節(jié)軟骨病變最嚴重的區(qū)域，并記錄該區(qū)域至股骨內(nèi)側髁外緣的距離（MRI評估和病理切片時參考）；用 10% 福爾馬林對標本進行固定、脫鈣及石蠟包埋，并對軟骨病變最嚴重區(qū)域進行切片，行 p16^INK4a 免疫組化染色，黃色或棕黃色為陽性區(qū)域。采用ImageJ軟件計算每高倍視野內(nèi)陽性細胞的平均光密度值（averageopticaldensity，AOD），選取6個高倍視野，取平均值作為最終結果。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)。對連續(xù)變量先行正態(tài)性及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布以 表示，組間比較行單因素方差分析；不符合正態(tài)分布以M（Q_L，Q_U） 表示，組間比較行Kruskal-Wallis H 或Mann-Whitney U 檢驗。非連續(xù)變量則以例 （%） 表示，組間比較行 χ² 檢驗。多因素分析采用最優(yōu)尺度回歸分析[9]。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.14組性別和體質(zhì)量比較

實驗過程中6只兔死亡，模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組各2只，最終共26只兔完成實驗。4組動物的性別和體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（均 Pgt;0.05 （表1）。

表14組動物性別和體質(zhì)量的比較

注：為 χ² 值，為 F 值。

2.24組關節(jié)軟骨 T₂ 值及 p16^INK4a 表達量比較

4組關節(jié)軟骨 T₂ 值差異有統(tǒng)計學意義（ Plt; 0.001（表2）；兩兩比較，止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組差異無統(tǒng)計學意義，且均明顯高于正常對照組，低于模型對照組（均 Plt;0.05） （表3，圖2）。4組關節(jié)軟骨 p16^INK4a 表達量差異有統(tǒng)計學意義（ （Plt;0.001 （表2）;兩兩比較，正常對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組差異均無統(tǒng)計學意義（均 Pgt;0.05 ），但均明顯低于模型對照組（均 Plt;0.05 （表3）。

表24組關節(jié)軟骨 T₂ 值及 p16^1NK4a 表達量比較 [M（Q_L，Q_U）] 一

注：AOD為平均光密度值。

表34組關節(jié)軟骨 T₂ 值及 p16^1NK4a 表達量的兩兩比較

注：AOD為平均光密度值。

2.3 多因素分析

多因素分析采用最優(yōu)尺度回歸分析，將實驗分組及 T₂ 值作為自變量， p16^INK4a 表達量作為因變量，結果顯示回歸模型有統(tǒng)計學意義（ F=450.356 ， Plt; 0.001）。該模型調(diào)整后的決定系數(shù)為0.989，提示該模型中約 90% 以上部分可被目前的自變量解釋。實驗分組、關節(jié)軟骨 T₂ 值兩者均與關節(jié)軟骨細胞p16^mK4a 表達量存在相關性 （Plt;0.05 ），其重要性分別為0.673、0.327，兩者之和 gt;0.999 ，提示上述2個因素占目前模型總解釋度的 99% 以上（表4）。變量轉換后的量化圖顯示： ① 模型對照組軟骨細胞 p16^INK4a 表達量的量化分級高于其他3組，而正常對照組、正痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組之間的軟骨細胞p16^INK4a 表達量的量化分級類似（圖3）； ② 關節(jié)軟骨p16^INK4a 表達量隨 T₂ 值的升高，先緩慢升高，再迅速升高，兩者呈非線性關系（圖4）。

圖2 T₂ mapping偽彩圖注：圖 2a～2d 分別為正常對照組、模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組 T₂ mapping偽彩圖， T₂ 值分別為41.57、61.70、51.69、52.88 ms

表4最優(yōu)尺度回歸模型結果

圖3 p16^?1NK4a 表達量預測模型的實驗分組量化圖注：A組為正常對照組，B組為模型對照組，C組為止痛健骨方組，D組為硫酸氨基葡萄糖組圖4 p16^1NK4a 表達量預測模型的 T₂ 值量化圖

3討論

骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展涉及多種結構，包括關節(jié)軟骨、軟骨下骨及滑膜等，其中關節(jié)軟骨損害是骨關節(jié)炎的病理基礎、基本病理變化及首要表現(xiàn)，是當前的研究熱點[10-11]。有研究表明，軟骨衰老在膝骨關節(jié)炎軟骨損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而 p16^INK4a 是表達于關節(jié)軟骨細胞上的一種生物標記，可衡量軟骨細胞衰老[12-13]。MRI功能序列 T₂ mapping可通過定量測量軟骨橫向弛豫時間，提供關節(jié)軟骨中細胞外基質(zhì)水含量、膠原纖維的結構信息及膠原纖維的排列方式，可無創(chuàng)、動態(tài)反映骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨的病理改變[14]。本研究通過 T₂ mapping 成像評估止痛健骨方防治膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨衰老的療效。

止痛健骨方可在骨關節(jié)炎發(fā)病機制的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[15-16]。本研究模型對照組中軟骨細胞p16^INK4a 表達升高，顯著高于其他3組，提示軟骨細胞衰老參與骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，而止痛健骨方防治骨關節(jié)炎的機制之一就是抑制軟骨細胞衰老[17-18]。關節(jié)軟骨退變時，MMP-1表達上調(diào)，導致關節(jié)軟骨基質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原降解、關節(jié)軟骨內(nèi)水含量相應上升，從而導致關節(jié)軟骨 T₂ 值升高，而止痛健骨方能降低MMP-1過度表達，引起軟骨基質(zhì)降解，延緩了關節(jié)軟骨內(nèi)膠原纖維破壞[19]，因此本研究中止痛健骨方組關節(jié)軟骨內(nèi)水含量較模型對照組低。本研究中止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組關節(jié)軟骨 T₂ 值均明顯低于模型對照組且高于正常對照組，提示 T₂ mapping可作為評估中藥治療骨關節(jié)炎療效的指標；另外，關節(jié)軟骨細胞 p16^INK4a 表達量隨 T₂ 值先緩慢上升，而后快速上升，兩者呈非線性關系，提示在多種機制參與的骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中， T₂ 值可能具備無創(chuàng)判斷關節(jié)軟骨衰老并監(jiān)測藥物防治療效的潛力。

本研究的局限性： ① 僅選取影像及病理中的1個指標評估關節(jié)軟骨損傷，未能充分揭示止痛健骨方在骨關節(jié)炎治療中的具體作用機制； ② 盡管止痛健骨方治療骨關節(jié)炎的療效得到肯定，但其延緩膝骨關節(jié)炎的具體有效成分有待進一步確認。

綜上所述，止痛健骨方可防治膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨衰老，且 T₂ mapping可作為藥物防治軟骨衰老的無創(chuàng)評估工具，有助于指導膝骨關節(jié)炎的臨床診斷與治療。

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（收稿日期 2024-05-25）