關(guān)鍵詞：半夏；疏松愈傷組織；果膠酶中圖分類號：Q945.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0457（2025）03-0079-09國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.011

半夏（Pinelliaternata（Thunb.）Breit.）為天南星科多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)重要中藥材之一，以其燥熱化痰、降逆止嘔等藥效著稱[1]。最新研究表明，半夏具有抗生育、降血脂以及治療冠心病等功效[2-3]。由于近年來對野生半夏的掠奪性挖采以及環(huán)境變化，其自然資源面臨枯竭，市場供需矛盾日益尖銳。人工種植是解決半夏市場需求的主要途徑，但長期采用塊莖繁殖導(dǎo)致病害嚴(yán)重[4]、種質(zhì)退化[5-7]、產(chǎn)量下降[8-9]等一系列問題。人工種子相比于半夏種莖具有低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢，因此，半夏人工種子技術(shù)已成為近年來的研究熱點(diǎn)[10-12]松散狀的愈傷組織生命力旺盛、增殖快、易分散，是懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)人工種胚的理想材料，經(jīng)過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可獲得大量質(zhì)地均一且易分散的同步化人工種胚。因此，明確半夏疏松愈傷組織形成的關(guān)鍵因素，掌握穩(wěn)定且高效誘導(dǎo)半夏疏松愈傷組織的方法對構(gòu)建半夏人工種子生產(chǎn)中人工種胚培養(yǎng)技術(shù)具有重要意義。

植物組織細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分含量的變化通常對細(xì)胞間連接產(chǎn)生顯著影響，最終反映在植物組織的整體結(jié)構(gòu)和質(zhì)地上[13]。植物細(xì)胞壁胞間層的主要成分是果膠質(zhì)，負(fù)責(zé)粘連相鄰細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞中果膠物質(zhì)在果膠酶的作用下發(fā)生降解，直接影響果膠含量和空間結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁出現(xiàn)內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)解離，細(xì)胞形態(tài)和大小發(fā)生變化，細(xì)胞間中膠層和初生壁受到影響，植物組織質(zhì)地最終發(fā)生變化[14-17]。胡留申等18發(fā)現(xiàn)桃的質(zhì)地與細(xì)胞壁原果膠含量呈極顯著正相關(guān)，同時(shí)與水溶性果膠含量、果膠酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。陳發(fā)河等[19]研究發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠促進(jìn)葡萄果實(shí)脫落，增強(qiáng)果膠酶的表達(dá)，并隨之引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變。陸玲鴻等[20]研究表明，弼猴桃果實(shí)軟化過程與細(xì)胞壁中果膠降解相關(guān)酶的活性變化密切相關(guān)。胡珊珊等[2研究表明，疏松愈傷組織的果膠含量顯著高于致密愈傷組織。這些都初步證實(shí)了果膠酶在半夏愈傷組織形態(tài)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用。

本研究通過直接添加外源果膠酶，驗(yàn)證果膠酶對半夏愈傷組織形成的影響，同時(shí)探究誘導(dǎo)愈傷組織內(nèi)源果膠酶活性變化的適宜條件，分析光照強(qiáng)度、蔗糖濃度、植物激素、多胺類物質(zhì)等因素對果膠酶活性的影響，從而促進(jìn)半夏疏松愈傷組織的形成，以期為半夏疏松愈傷組織形成的關(guān)鍵性因素提供有力依據(jù)，為優(yōu)化培養(yǎng)半夏疏松愈傷組織關(guān)鍵技術(shù)體系提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1材料

半夏（Pinelliaternata（Thunb.）Breit.）由貴州省赫章縣半夏藥材基地（北緯 27^°28^′ ，東經(jīng) 104^°34^′ 海拔 2199.67m 提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1半夏愈傷組織誘導(dǎo)

選取苗齡 30d 的半夏無菌苗葉片為外植體。以MS為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖 40g/L ，瓊脂 7g/L 并添加 1.0mg/L 2，4-D 和 0.5mg/L6?BA 。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基 pH5.8 ，培養(yǎng)溫度（ 25±1）^eC ，光照強(qiáng)度 900～1200lx 。

1.2.2半夏不同愈傷組織細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)觀察

組織結(jié)構(gòu)觀察采用常規(guī)石蠟切片法[22]，選取不同的愈傷組織，用 50% 酒精-乙酸-福爾馬林（FAA）固定液固定過夜，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、復(fù)水、番紅/釘紅-固綠染色、脫水、中性樹膠封片等步驟制成切片，最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.3探究外源果膠酶對半夏疏松愈傷組織形成的影響

選取2次繼代且生長一致的疏松愈傷組織，配置不同果膠酶活力 （0，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0U/mL） ）的溶液，經(jīng) 0.45mm 細(xì)菌過濾器過濾后，加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)觀察愈傷組織的形態(tài)變化，15d后取樣測定果膠含量。

1.2.4誘導(dǎo)愈傷組織果膠酶的培養(yǎng)條件

選取2次繼代以后生長一致的疏松愈傷組織，設(shè)計(jì)光照強(qiáng)度 1800～2000.2500～3000kx） 、蔗糖質(zhì)量濃度（0、10、30，40，50，60g/L ）、多胺類物質(zhì)（精胺、亞精胺、腐胺） （0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mg/L） 、植物激素質(zhì)量濃度2，4-D（ （0.5，1.0，2.0mg/L ）、IAA（0.5、1.0、2.0mg/L ） ，6-BA（0.5，1.0Ω，2.0mg/L） ）的單因素試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理30瓶，3次重復(fù)。 15d 后取樣測定果膠酶活性，同時(shí)觀察愈傷組織的形態(tài)、質(zhì)地變化。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)測定

水溶性果膠、原果膠的提取與測定采用咔唑-濃硫酸比色法[23-24]；果膠酶的提取與測定主要基于多聚半乳糖醛酸酶，采用DNS比色法[25-26]。

1. 2.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2010、DPS 7.05、GraphPadPrism7.0和AdobeIllustratorCC2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1半夏不同愈傷組織的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異

在獲得半夏愈傷組織的基礎(chǔ)上，選擇初代誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)中得到的四種不同愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異觀察，包括黃色胚性疏松愈傷組織I、透明松散愈傷組織II、白色松軟愈傷組織III、黃色致密愈傷組織IV，觀察它們的組織與細(xì)胞形態(tài)差異。I型愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松、質(zhì)地松脆易分散，嫩黃色顆粒狀分布，膨大生長，增殖迅速，細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示其核質(zhì)比大、內(nèi)含物豐富，細(xì)胞分裂旺盛，具有分化成體細(xì)胞胚的能力（圖1-a）;II型愈傷組織主要出現(xiàn)在初代誘導(dǎo)的半夏愈傷組織中，透明且含水量高，呈雪花狀，生長緩慢。這些細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核較大，內(nèi)含物豐富，但細(xì)胞分裂進(jìn)度減緩，分裂能力不高（圖1-f）;II型愈傷組織結(jié)構(gòu)松軟、具有黏性，白色或透明，生長緩慢，細(xì)胞多為圓形，核小，少有分裂的細(xì)胞（圖 _1-g ）；IV型愈傷組織致密結(jié)塊團(tuán)，容易發(fā)生器官分化，難以繼代增殖，細(xì)胞核較大，分裂能力強(qiáng)（圖1-h）。

2.2外源果膠酶對半夏疏松愈傷組織形成的影響

在培養(yǎng)基中添加不同果膠酶活力的溶液進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加了果膠酶液的培養(yǎng)基中，愈傷組織生長更加旺盛，且愈傷組織質(zhì)地更加疏松（圖2-a和圖2-b）。經(jīng)過果膠含量測定結(jié)果表明（圖3），隨著外源果膠酶活力的提高，愈傷組織水溶性果膠逐漸增加，原果膠含量逐漸減少。從圖1可知，當(dāng)添加的果膠酶液活力超過 20.0U/mL 時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)明顯的疏松增殖的現(xiàn)象。然而，當(dāng)用含果膠酶液的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)超過25d后（圖2-c和圖2-d），愈傷組織基本停正增殖，生長緩慢，有的甚至出現(xiàn)褐化、污染的現(xiàn)象。

注：a為未添加果膠酶液培養(yǎng)15d的處理；b為添加果膠酶活力為 20.0U/mL 的酶液培養(yǎng)15d的處理;c為未添加果膠酶液培養(yǎng)25d的處理；d為添加果膠酶活力為 20.0U/mL 的酶液培養(yǎng)25d的處理。

2.3不同光照強(qiáng)度對半夏愈傷組織果膠酶誘導(dǎo)的影響

測定不同光照強(qiáng)度下培養(yǎng)的半夏疏松愈傷組織的果膠酶活性，結(jié)果表明（圖4-a），隨著光照強(qiáng)度的增加，愈傷組織果膠酶活性持續(xù)增強(qiáng)，但當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到某一閾值后，果膠酶活性出現(xiàn)減弱的現(xiàn)象。在 1800～2000lx 的光照強(qiáng)度下，半夏疏松愈傷組織細(xì)胞壁果膠酶活性達(dá) 4.87U/g ，此時(shí)，水溶性果膠含量相對較高（圖4-b），愈傷組織質(zhì)地較為疏松，且呈現(xiàn)旺盛的增殖狀態(tài)。因此可知，此條件下，果膠酶活性適合半夏疏松愈傷組織的形成。隨著光照強(qiáng)度的增加，果膠酶活性逐步增強(qiáng)，但光照強(qiáng)度過高時(shí)，部分果膠酶失去活性，愈傷組織質(zhì)地不再均勻疏松，局部出現(xiàn)白色脈絡(luò)狀組織，愈傷組織開始變得致密化（圖5-a）。

2.4不同質(zhì)量濃度的蔗糖對半夏愈傷組織果膠酶誘導(dǎo)的影響

由圖6-a所示，隨著蔗糖質(zhì)量的增加，果膠酶的活性呈現(xiàn)出逐步增強(qiáng)的趨勢，二者之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到 60g/L 時(shí)，果膠酶的活性達(dá)到峰值，為 5.14U/g 。此時(shí)，原果膠的含量顯著下降至152. 77μg/g ，而水溶性果膠的含量則增加至 120.43μg/g （圖6-b）。然而，過高的酶活性導(dǎo)致果膠降解過度，進(jìn)而引發(fā)愈傷組織出現(xiàn)水漬化現(xiàn)象，質(zhì)地變得松軟（圖5-b）。綜合來看，誘導(dǎo)果膠酶活性最適宜的蔗糖濃度為 40g/L ，此時(shí)果膠酶活性保持在 4.31U/g ，疏松愈傷組織呈現(xiàn)出嫩黃色，表面膨脹突起，生長狀態(tài)旺盛，

2.5不同多胺類物質(zhì)對半夏愈傷組織果膠酶誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)測定了3種多胺類物質(zhì)在不同濃度條件下對愈傷組織果膠酶活性變化的影響。由圖 7-a 可知，腐胺濃度升高導(dǎo)致了果膠酶活性逐漸減弱，原果膠含量增加，水溶性果膠含量減少。在較低腐胺質(zhì)量濃度條件下 （0.5～1mg/L 果膠酶活性相對較高，處于 3～3.24U/g 范圍內(nèi)。對于精胺處理組，果膠酶的活性普遍較低，最高為 1.94U/g ，最低為 1.44U/g ，在精胺濃度為 5mg/L 時(shí)，果膠酶活性達(dá)到最高，隨后隨著濃度的增加而降低；在精胺濃度為 1μg/g 時(shí)，原果膠含量最高，隨后逐步減少（圖7-b）；水溶性果膠含量呈不規(guī)則變化（圖7-c），但此時(shí)半夏愈傷組織的質(zhì)地仍然主要呈現(xiàn)為堅(jiān)硬結(jié)塊化，生長也較緩慢（圖5-c）。亞精胺的濃度變化對果膠酶活性的影響并不顯著，果膠酶活性始終穩(wěn)定在 2.15～2.62U/g 之間，此時(shí)愈傷組織的質(zhì)地沒有明顯變化，但果膠酶活性普遍高于精胺處理組。整體而言，多胺類物質(zhì)處理中，果膠酶的活性雖有變化但整體普遍較低，均在 1.44～3.24U/g 的范圍內(nèi)，說明多胺物質(zhì)對半夏愈傷組織果膠酶活性的增強(qiáng)作用相對有限。

注：a為多胺類物質(zhì)對愈傷組織果膠酶活性的影響;b為多胺類物質(zhì)對愈傷組織原果膠含量的影響;c為多胺類物質(zhì)對愈傷組織水溶性果膠含量的影響。

2.6不同植物激素對半夏愈傷組織果膠酶誘導(dǎo)的影響

由圖8可知，在植物激素的作用下愈傷組織果膠酶活性出現(xiàn)明顯的波動(dòng)，隨著2，4-D濃度的增加，果膠酶活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)培養(yǎng)基中有 2.0mg/L 的2，4-D時(shí)，愈傷組織果膠酶的活性達(dá)到 5.07U/g （圖8-a），原果膠含量減少，水溶性果膠含量增加到 99.35μg/g （圖8-b至c），同時(shí)產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地疏松（圖5-d），保持胚性增殖。高濃度的IAA也會誘導(dǎo)產(chǎn)生高活性的果膠酶，當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為 2.0mg/L 時(shí)，果膠酶活性達(dá)到 6.79U/g ，原果膠大幅降解，水溶性果膠大量生成，此時(shí)的愈傷組織質(zhì)地也變得松軟（圖5-e）。6-BA誘導(dǎo)果膠酶釋放活性的能力與IAA相反，隨著6-BA濃度的升高，果膠酶活性明顯減弱，僅占同在 2.0mg/L 質(zhì)量濃度下IAA誘導(dǎo)的果膠酶活性的三分之一，原果膠降解少，水溶性果膠的生產(chǎn)量較低，此時(shí)愈傷組織逐漸致密、結(jié)團(tuán)塊，愈傷組織局部呈綠色，生長速度慢（圖5-f。不同植物激素的處理結(jié)果表明，生長素誘導(dǎo)果膠酶活性作用較明顯，而細(xì)胞分裂素則相對較弱。然而，過強(qiáng)的果膠酶活性可能導(dǎo)致原果膠過度降解，水溶性果膠大量生成，進(jìn)而促使細(xì)胞壁及胞間層結(jié)構(gòu)松散，使愈傷組織變得松軟甚至喪失增殖活力。因此，單獨(dú)添加高濃度的2，4-D或較低濃度的IAA能夠誘導(dǎo)果膠酶發(fā)揮較高活性，適度酶解原果膠，減少細(xì)胞間的連接，從而獲得質(zhì)地疏松、分裂旺盛的半夏疏松愈傷組織。

注：a為植物激素對愈傷組織果膠酶活性的影響;b為植物激素對愈傷組織原果膠含量的影響；c為植物激素對愈傷組織水溶性果膠含量的影響。

3 討論與結(jié)論

質(zhì)地疏松、增殖旺盛、具有胚性、生長迅速的疏松愈傷組織是懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)人工種胚的理想材料，這類愈傷組織能夠在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中分散，形成懸浮的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，不斷分化發(fā)育形成胚狀體或者小塊莖[27-28]。植物細(xì)胞壁具有多層結(jié)構(gòu)，包括胞間層、初生壁、次生壁。其中，最重要的是連接相鄰兩個(gè)初生壁之間的胞間層，其主要成分是果膠質(zhì)[29]。研究表明在果膠酶作用下，細(xì)胞壁物質(zhì)發(fā)生分解，細(xì)胞間連接減弱，植物組織質(zhì)地變得軟化或疏松[30-31]，這與本研究結(jié)果具有相似之處。本研究直接在半夏疏松愈傷組織培養(yǎng)中添加外源果膠酶液，當(dāng)酶液活力超過 20.0U/mL 時(shí)，愈傷組織的質(zhì)地更加松散，生長更加旺盛，表明半夏愈傷組織的質(zhì)地與細(xì)胞壁果膠酶活性的變化密切相關(guān)，與李智超等[32在豆腐柴愈傷組織誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究中的結(jié)果一致。然而，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過25d后愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。這可能是由于過長的培養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致酶液失活或其對愈傷組織作用過強(qiáng)

而導(dǎo)致的[33-34] 。

在組織培養(yǎng)過程中，存在許多影響愈傷組織形成的因素。已有研究表明，光照強(qiáng)度、蔗糖濃度、多胺類物質(zhì)、植物激素對植物愈傷組織誘導(dǎo)具有重要作用[35-38]。本研究通過單因素試驗(yàn)分析4種因素各自對果膠酶活性的影響，結(jié)果表明當(dāng)果膠酶活性過高時(shí)，愈傷組織容易出現(xiàn)白化、濕軟的現(xiàn)象，而酶活性較低時(shí)，愈傷組織會變得堅(jiān)實(shí)、結(jié)塊化，難以形成疏松愈傷組織。其中，當(dāng)果膠酶活性保持在4～5U/g 的范圍時(shí)，半夏疏松愈傷組織容易呈疏松易分散的顆粒狀，保持著良好的生長狀態(tài)。這與茄子、梨等多種植物的質(zhì)地變化與果膠酶和果膠的相關(guān)性研究結(jié)果一致[3941]。隨著光照強(qiáng)度、蔗糖、2，4-D和IAA的濃度的升高，果膠酶活性增強(qiáng)，而腐胺、6-BA濃度與果膠酶活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢，亞精胺對果膠酶的活性幾乎沒有影響。其中光照、蔗糖和植物激素能夠明顯提高半夏疏松愈傷組織果膠酶活性，均維持在 4～7U/g 之間，而多胺類物質(zhì)對果膠酶活性提升的作用普遍較低，其培養(yǎng)下的半夏疏松愈傷組織的果膠酶活性大約在 1.44～ 3.24U/g 。因此我們初步篩選認(rèn)為誘導(dǎo)內(nèi)源果膠酶活性達(dá)到利于半夏疏松愈傷組織形成的范圍的主要條件中，適宜光照強(qiáng)度為 1800～2000lx ，蔗糖質(zhì)量濃度為 40mg/L ，植物激素為 2.0mg/L 的2，4-D和 1.0mg/L 的IAA。

本研究進(jìn)一步優(yōu)化了半夏愈傷組織培養(yǎng)條件，并對半夏的大規(guī)模生產(chǎn)、人工種子培養(yǎng)提供了重要的理論依據(jù)與試驗(yàn)參考。但在半夏疏松愈傷組織的形成中，影響果膠酶活性以及植物愈傷組織質(zhì)地的因素包括但不限于本研究所提到，其中，對酶活性影響較大的溫度、pH值等因素在植物培養(yǎng)過程中具有常規(guī)范圍，并且對半夏疏松愈傷組織進(jìn)一步探究其人工種子的影響因素也更為復(fù)雜。葉玲娟等[42]發(fā)現(xiàn)接種量對相思樹的愈傷組織形成具有顯著影響。李晉華等[43]對小黃姜人工種子技術(shù)的研究中，對溫度等多種培養(yǎng)因素進(jìn)行調(diào)整，探索得到能使人工種子萌發(fā)率和成芽率達(dá)到最高的培養(yǎng)條件。在這些常規(guī)有效范圍內(nèi)如何既能保證植物組織的正常生長發(fā)育，又能達(dá)到誘導(dǎo)果膠酶活性變化的目的，最后獲得理想狀態(tài)的培養(yǎng)材料，獲取到植物人工種子，值得進(jìn)一步探究。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳 胡吉鳳）

作者簡介：羅伶俐（2004—），女，漢族，貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2023級生物技術(shù)專業(yè)本科生，E-mail：2263555326@ qq. com.

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Studyon the Role of Pectinase in the Formation of Loose Callus of Pinellia ternata

Luo Lingli， Tian Yuhang，Hang Ye，Long Zhengxi，Tang Liu，Liu Miao*

（SchoolofLife Sciences，KeyLaboratoryofMountain Plant Resources Conservationand Germplasm Innovation，Ministry

ofEducation），Guizhou University，Guiyang 55oo25，Guizhou，China）

Abstract：ToexploretheroleofpectinaseintheformationofPinelliaternataLoosecallusanditsoptimal induction conditions， P . ternata calls was used as experimental materials，the appropriate conditions for inducing changes in endogenous pectinase activity in the calls was investigated by directly adding exogenous pectinase solution，and he efectsof diffrent light intensities，sucrose concentrations，phytohormones，and polyaminecombinationsof treatments on the pectinase activity were studied.The results showed that，（1）When exogenous pectinase solution was added directlyintotheculture mediumandtheenzymeactivity exceeded 20.O U/mL，the textureof thecalus was obviously loosenedwith significantlyaccelerating of the growth，which proved thattherewasacloserelationshipbetweenthe texture of the callus of P . ternata and the changes of the pectinase activity in the cell wall. （2）under the experimental conditions，when the concentrations of sucrose， ^2，4 -D，and IAA were elevated as well as the light intensity was enhanced，thepectinaseactivityshowedanincreasing trend，onthecontrary，theelevatedconcentrationsof putrescine and 6-BA ledtoadecrease in pectinaseactivity；whereas pectinase activitydid not difer with the concentrationof spermine.Among them，light，sucrose and phytohormones significantly increased the pectinase activity of P .ternata loose callus to 4 ＼～7 U/ g ，while the effect of polyamines was weak，with the pectinase activity of the callus only ranging from 1.44 to 3.24 U/ g .The results of this paper showed that the key condition for endogenous pectinase activity to reach the appropriate range （4＼～5U/ g ）concludes sucrose of 40g/L ， ^2，4 -D of 2.0 mg/ L ， IAA of 1.0 mg/L and light intensity of 1800～2000 lx in MS medium，which could promote the formation of loose callus of P ternate.

Keywords：Pinellia ternata；loose callus;pectinase