中圖分類號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003-935X（2025）02-0031-08

Isolation Conditions of Protoplasts in Eleusine indica

CUI Xinyu ^1，2 ， JIANG Hao ^1，2 ， TIAN Xingshan ¹ ， ZHANG Chun1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of New Techniques for Plant Protection in Guangdong，Guangzhou 51O640，China; 2.School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 51O631，China）

Abstract：The isolation and cultivation of high-viability plant protoplastsserveas the foundation for studying plant physiology，biochemistry，andmolecularbiologyatthecellularlevel.However，duetothepresenceofacellwall surrounding plant protoplasts，thereare numerouschallnges in their isolationandculture.Inthisstudy，usingleaves andsheaths of the globall invasive weed Eleusine indicaas materials，single-factor experiments were conducted to optimize the conditions for protoplast preparation from E .indica，including material quantity，enzyme solution composition，enzymatic hydrolysis time，and centrifugation speed.High-activity protoplastsof E .indica were successfully obtained.Specifically，2 gof leaves from E .indicaplants at 5-6 leaf-stage were enzymatically hydrolyzed for 3 hours in a 10mL enzyme solution containing 1.0% cellulase， 0.5% macerozyme，and 0.5% pectinase.The protoplasts were then collected by centrifugation at 2 500r/min .The maximum protoplast yield reached 2.075× （204號(hào) （204 10⁷ protoplasts/ g ， with over 90% viability.Furthermore，the yield of protoplasts prepared from leaves was higher than that from sheaths. This study established an optimized method for preparing protoplasts from E .indica leaves，laying the groundwork for studying the herbicide resistance mechanisms of E .indica at the single-cell level and providing a reference for the preparation of protoplasts from other grass weeds.

Key words： Eleusine indica ; protoplast; enzymatic hydrolysis ;single - cell sequencing

近年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（scRNA-Seq）在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但植物單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)展緩慢，難點(diǎn)之一是植物原生質(zhì)體的分離與穩(wěn)定培養(yǎng)。scRNA-Seq已在少數(shù)植物物種中得到證實(shí)，包括模式植物（如擬南芥）、農(nóng)作物（如水稻）和生物能源作物（如楊樹）等[1]。Wang等利用scRNA-Seq技術(shù)闡明了茶葉中兒茶素酯代謝的復(fù)雜發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，挖掘出茶葉獨(dú)特味道的來源[2]；Liu等利用scRNA-Seq技術(shù)揭示了花生葉片分化發(fā)育軌跡[3]。目前國(guó)內(nèi)外研究者從分子水平和組織水平開展了雜草抗藥性機(jī)制研究，如Pan等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）發(fā)現(xiàn)了光頭稗（Echinochloacolona）對(duì)草甘麟的非靶標(biāo)抗性新機(jī)制[4]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)利用基因組學(xué)技術(shù)，揭示了牛筋草中草甘麟靶基因復(fù)增驅(qū)動(dòng)牛筋草抗草甘麟的新機(jī)制[5]。但傳統(tǒng)的分子和組學(xué)技術(shù)不足以揭示植物復(fù)雜性背后的特定細(xì)胞類型的分子機(jī)制;通過scRNA-Seq等新型生物技術(shù)，從單細(xì)胞水平研究雜草抗藥性機(jī)制的研究尚未見報(bào)道，主要制約因素之一是高質(zhì)量植物原生質(zhì)體的制備較難。除草劑的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致雜草抗性種群發(fā)生與發(fā)展，給農(nóng)田雜草防控帶來極大挑戰(zhàn)。雜草抗性機(jī)制研究是科學(xué)防控農(nóng)田雜草的前提。目前國(guó)際上雜草抗性機(jī)制研究主要集中在分子和組織水平。因雜草原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)技術(shù)不夠成熟，除草劑脅迫下雜草細(xì)胞層面上的活動(dòng)鮮有研究。

植物原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁，由質(zhì)膜包裹著的裸露細(xì)胞。酶解法是原生質(zhì)體制備的常用方法，水稻、玉米和煙草等作物已有較成熟的原生質(zhì)體分離體系，覆蓋到發(fā)育的不同階段[6。但由于不同植物的細(xì)胞壁組分不完全相同，因此不同植物原生質(zhì)體提取和培養(yǎng)條件也不相同，甚至同一植物的酶解條件并不適用于所有品種。Jenes等以44種基因型水稻為材料，僅有20種基因型水稻品種成功分離到原生質(zhì)體[7]。植物葉子、根、愈傷組織等均可用于制備原生質(zhì)體，原生質(zhì)體含有完整的遺傳物質(zhì)，是研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、代謝以及響應(yīng)外界脅迫生理過程的有力材料，還可用于遺傳轉(zhuǎn)化、基因瞬時(shí)表達(dá)、亞細(xì)胞定位等試驗(yàn)的研究。利用模式植物擬南芥葉肉原生質(zhì)體已開展了多種激素信號(hào)通路以及非生物和生物脅迫應(yīng)激信號(hào)通路等分子研究[8]。趙小強(qiáng)利用早熟禾原生質(zhì)體開展了體細(xì)胞雜交研究[。唐然等優(yōu)化了華南象草和菊花花瓣等原生質(zhì)體的分離條件，并利用原生質(zhì)體建立了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，用于基因工程和分子育種等研究[10-11] 。

牛筋草［Eleusineindica（L.）Gaertn.]是一年生禾本科穆屬植物，是一種全球性的農(nóng)田惡性雜草，在我國(guó)廣泛分布，尤其在華南地區(qū)發(fā)生危害嚴(yán)重[12]。本研究以牛筋草為材料，擬探明牛筋草原生質(zhì)體制備的最佳酶解條件，包括材料用量、酶液組分、酶解時(shí)間和離心速率等，比較優(yōu)化后的酶解條件對(duì)牛筋草葉鞘和葉組織原生質(zhì)體的提取效果，從而建立一種高效的牛筋草原生質(zhì)體制備體系。旨在建立一種全球性惡性雜草牛筋草原生質(zhì)體的制備方法，以期為從單細(xì)胞水平研究牛筋草相關(guān)科學(xué)問題提供技術(shù)支撐，也為其他禾本科雜草原生質(zhì)體的制備提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試牛筋草由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所雜草研究室提供

1.2試劑配制與原生質(zhì)體分離

1.2.1 酶解液的制備 主要試劑：纖維素酶RS、離析酶R-10、果膠酶Y-23均購(gòu)自日本YakultHonsha公司;2-（ N- 嗎啡啉）乙磺酸（MES）、甘露醇、牛血清蛋白（BSA） ，NaCl，KCl，CaCl₂ 、巰基乙醇等生化試劑均購(gòu)自于Solarbio公司。試驗(yàn)所用W5溶液的配制：154mmol/LNaCl、125 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L MES（ pH 值5.7），用KOH將 pH 值調(diào)至5.8；在高壓滅菌鍋 0.1MPa.121.3^qC 條件下滅菌10～30min 。酶解液配制： 0.6mol/L 甘露醇、10 mmol/L MES、0. 1% BSA、1 mmol/L CaCl₂ 、5 mmol/L β- 巰基乙醇。

酶液配制：稱量 _1.092g 甘露醇和 0.0195g MES加入水中；用容量瓶定容至 10mL ，將該溶液轉(zhuǎn)移至 10mL 燒杯中；清洗 pH 計(jì)，用1mol/LKOH調(diào)節(jié) pH 值至5.7；繼續(xù)加人 _0.1g 纖維素酶RS，0.05g 離析酶R-10和 0.05g 果膠酶Y-23（以上步驟全部在磁力攪拌器上進(jìn)行，待溶液澄清后用保鮮膜封口）；在 55^qC 水浴鍋中水浴 10min ；室溫（ 25°C ）放置使酶液溫度降至室溫；繼續(xù)加入0.01gBSA，10μL 1mol/LCaCl₂ 母液， 7μL 巰基乙醇。攪拌 10min 以上，避光保存，若多次使用可分管保存至 -20^°C 冰箱。凍存的酶液重新解凍后，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?，直至白色沉淀完全溶解，待用?/p>

1.2.2原生質(zhì)體的分離參照油莎豆原生質(zhì)體的分離方法[13]，利用酶解法分離牛筋草原生質(zhì)體，主要步驟如下：（1）從5～6葉期的牛筋草植株上剪下葉片 1～2g 。吸取 2mL 預(yù)冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液浸泡，用刀片將葉片切成 1mm 的細(xì)段，盡量一刀切碎不要反復(fù)切割，避免細(xì)胞受到損傷。將其轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液中，避光放置 10～20min 。（2）吸棄甘露醇，加入10mL 酶解液，用封口膜密封，在 28°C70r/min 搖床中避光酶解 ³h 。（3）用300目的細(xì)胞過濾器過濾酶解液。（4）將濾液貼壁移至圓底離心管，室溫下 1500r/min 離心 10min 。（5）小心取出離心管，輕輕吸棄上清液。加入 3mL W5溶液到離心管中，上下緩慢顛倒混勻， 1500r/min 離心 10min 。（6重復(fù)“步驟（5）\"1次，至上清液變明亮。將原生質(zhì)體溶于 1mL W5溶液中，置于冰上避光保存。

1.2.3原生質(zhì)體的觀察與計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)。吸取少量純化后的原生質(zhì)體懸浮液于血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量，重復(fù)3次。計(jì)數(shù)時(shí)一定要保持顯微鏡載物臺(tái)水平，不能傾斜，逐次計(jì)算中央大方格內(nèi)25個(gè)中方格里的原生質(zhì)體。計(jì)數(shù)規(guī)則為記上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。然后再根據(jù)下式求出 1mL 懸浮液中原生質(zhì)體的數(shù)量：1mL 懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)量 μ=1σ 個(gè)大方格0 （0.1mm³ ）懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù) ×10⁴ 。之后再根據(jù)每個(gè)處理組提取液的體積計(jì)算總原生質(zhì)體數(shù)量，然后根據(jù)材料用量計(jì)算得出 1g 材料（如葉片）所能提取的原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.4原生質(zhì)體活力的測(cè)定采用熒光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA）對(duì)原生質(zhì)體的活力進(jìn)行染色鑒定。FDA用丙酮配制成 5mg/mL 溶液，然后取 500μL 原生質(zhì)體懸浮液，加入 5μL 5mg/mL FDA，輕輕混勻后染色 10min 。取 10μL 在熒光顯微鏡下檢測(cè)其活力，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)。同一視野范圍內(nèi)熒光條件下統(tǒng)計(jì)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)量（有活力）以及白光條件下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體總數(shù)量，隨機(jī)選擇10個(gè)視野。每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。原生質(zhì)體活力計(jì)算公式如下：原生質(zhì)體活力 Σ=Σ 綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)量/原生質(zhì)體總數(shù) ×100% 。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1最佳酶液組分和濃度的確定本試驗(yàn)在甘露醇預(yù)處理后，分別加入不同組分的酶液（表1）進(jìn)行酶解，以確定最佳酶液組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他試驗(yàn)條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.3.2最佳組織部位的確定分別選取牛筋草植株的葉鞘和葉片，進(jìn)行原生質(zhì)體制備的最佳組織部位篩選。除試驗(yàn)材料選取的組織部位不同外，其他試驗(yàn)條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.3.3材料用量的確定在最佳組織部位的基礎(chǔ)上，分別取 _{0.5，1.0，2.0g} 牛筋草嫩葉，進(jìn)行原生質(zhì)體制備最佳材料用量的確定，其他試驗(yàn)條件均同“1.2.2\"節(jié)。

1.3.4最適離心速率的確定在最佳組織部位和最佳材料用量的基礎(chǔ)上，分別以500、1500、2500r/min 的離心速率對(duì)濾液進(jìn)行離心，其他試驗(yàn)條件均同\"1.2.2”節(jié)。

1.3.5最適酶解時(shí)間的確定在甘露醇預(yù)處理后，分別設(shè)置酶解時(shí)間為 ^1，2，3h ，其他試驗(yàn)條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用IBMSPSS25軟件對(duì)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，采用最小顯著性差異法（ LSD） 進(jìn)行差異顯著性判定（ α=0.05 ）。

2 結(jié)果與分析

2.1酶液組分和濃度對(duì)牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

纖維素酶和離析酶是酶解法分離植物原生質(zhì)體常用的關(guān)鍵酶，果膠酶次之，三者的不同用量組合會(huì)影響牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力[14]。為了篩選高質(zhì)量制備牛筋草原生質(zhì)體的酶組合用量，設(shè)置了7種不同用量水平的纖維素酶、離析酶和果膠酶組合進(jìn)行篩選。由表2可知，單獨(dú)使用纖維素酶、離析酶和果膠酶時(shí)，纖維素酶提取牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，離析酶和果膠酶無顯著差異，但均顯著低于纖維素酶（ Plt;0.05） ?？梢娎w維素酶在牛筋草原生質(zhì)體制備中起主要作用。隨著纖維素酶的用量從 1.0% 增加到 2.0% （組合4和組合5），牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量顯著增加（ Plt; 0.05）。離析酶用量對(duì)牛筋草原生質(zhì)體的制備也產(chǎn)生較大影響，隨著離析酶用量從 0.5% 增加到1.0% （組合4和組合6），牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量也顯著增加（ Plt;0.05） 。整體而言，當(dāng)酶液組合用量為 1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶（組合7）時(shí)，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，達(dá)到1.675×10⁷ 個(gè) ，是7個(gè)組合中制備牛筋草原生質(zhì)體的最優(yōu)組合。

2.2酶解體系對(duì)葉片和葉鞘組織的提取效果

不同組織的細(xì)胞類型、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞數(shù)目可能存在差異，這也是影響原生質(zhì)體制備效果的關(guān)鍵因素[14]。為了能夠高效制備牛筋草原生質(zhì)體，比較了優(yōu)化后的酶解體系對(duì) 5～6 葉齡期牛筋草葉鞘和葉片組織的原生質(zhì)體提取效果。在相同的酶解條件和相同重量組織材料下，葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，達(dá)到 2.8×10⁶ 個(gè) /g ，葉鞘的原生質(zhì)體產(chǎn)量略低，約 2.5×10⁶ 個(gè) ??/g ，牛筋草的葉片分離出的原生質(zhì)體的活力略大于葉鞘，但兩者無顯著差異，均在 90% 左右（表3和圖1）。從原生質(zhì)體的細(xì)胞形態(tài)來看，葉片和葉鞘組織之間的差異比較明顯：葉鞘的原生質(zhì)體明顯小于葉片的原生質(zhì)體，且葉鞘的原生質(zhì)體中葉綠體較少，顏色較淺，大多數(shù)細(xì)胞是透明的，而葉片中的原生質(zhì)體較大且顏色深，葉綠體含量較多（圖2）。因此，用牛筋草葉片與葉鞘組織制備原生質(zhì)體的效果表現(xiàn)為幼嫩葉片 gt; 幼嫩葉鞘，即幼嫩葉片是制備牛筋草高質(zhì)量原生質(zhì)體的理想材料。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 ），下表同。

A、B分別為熒光染色后牛筋草葉片、葉鞘原生質(zhì)體在10倍物鏡下的視野

2.3材料用量對(duì)牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響材料用量是影響原生質(zhì)體制備效率的重要因素之一，濃度、體積一定的酶液所能酶解消化的植物材料是有限的。從表4可知，隨著牛筋草葉片材料用量的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也顯著增加（ Plt;0.05. ）。當(dāng)葉片材料用量為 2.0g 時(shí)，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，達(dá) 2.075×10⁷ 個(gè) /g ?？梢?0mL 由 1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶組合的酶液的酶解能力以 2.0g 牛筋草葉片為宜。

2.4離心速率對(duì)牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

植物材料經(jīng)酶解后需通過低速離心進(jìn)行分離純化。其中離心速率的選擇對(duì)原生質(zhì)體的分離效果至關(guān)重要。由表5可知，當(dāng)離心速率從500r/min 提升到 1500r/min 時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加（ Plt;0.05. ）。當(dāng)離心速率從 1500r/min 提升到 2500r/min 時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量無顯著差異。因此 1500～2500r/min 是牛筋草原生質(zhì)體純化時(shí)的最佳離心速率范圍。

2.5酶解時(shí)間對(duì)牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

適宜的酶解時(shí)間是原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的重要保障[13]。由表6可知，牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)。酶解時(shí)間從^1h 增加到 ^3h ，原生質(zhì)體產(chǎn)量從較低水平（ 2.5× 10⁵ 個(gè) /g ）逐漸達(dá)到較高水平 （5.0×10⁶ 個(gè) /g ；因此，在本組試驗(yàn)中牛筋草原生質(zhì)體制備的最優(yōu)酶解時(shí)間為 ³h ，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá) 5.0×10⁶ 個(gè)/g。

3討論與結(jié)論

植物原生質(zhì)體可以通過機(jī)械分離法或酶解分離法分離出來，機(jī)械分離主要是將細(xì)胞放在高滲糖溶液中使材料質(zhì)壁分離，然后通過磨碎植物組織從傷口釋放出完整的原生質(zhì)體[14]。該方法操作困難、適用范圍小、所得到的原生質(zhì)體活性低[14-15]。相比之下，酶解法分離原生質(zhì)體操作簡(jiǎn)單、效率高，適用范圍廣，是目前常用的植物原生質(zhì)體制備方法[9]

酶解液的組分及濃度是影響原生質(zhì)體分離的關(guān)鍵因素[9]。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素、果膠及少量半纖維素，因此，植物原生質(zhì)體分離研究中一般采用纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、離析酶等進(jìn)行分離[16]。不同植物或同一植物不同部位細(xì)胞的細(xì)胞壁成分和比例不完全相同[17]，不同植物最適酶解液的組分及濃度與其細(xì)胞壁組分相關(guān)。史曉朋的研究表明，由于甘蔗細(xì)胞壁含半纖維素較少，當(dāng)半纖維素酶濃度從 0.3% 提高到 1.0% 時(shí)，甘蔗原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力均下降，過多的半纖維素酶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞引起損傷[；禾本科植物的細(xì)胞壁果膠含量較低，當(dāng)在酶液中含有較高濃度的果膠酶時(shí)會(huì)影響早熟禾原生質(zhì)體的活力，一般禾本科植物采用較低濃度的果膠酶（0.5% ）[18]。郭艷萍研究發(fā)現(xiàn)，離析酶的濃度對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量影響很大，適宜的離析酶濃度可以顯著提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量[19]。本試驗(yàn)比較了7種不同酶配比組合對(duì)牛筋草葉片原生質(zhì)體分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)在酶解時(shí)間、離心速率等其他試驗(yàn)條件一致的情況下，隨著纖維素酶濃度從 1.0% 提高至 2.0% ，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量顯著增加（ Plt;0.05 ），細(xì)胞數(shù)量增加了1倍，這說明牛筋草葉片細(xì)胞中細(xì)胞壁的纖維素含量較高。離析酶和果膠酶濃度的升高也對(duì)牛筋草原生質(zhì)體的分離效果產(chǎn)生顯著影響，尤其是加入 0.5% 果膠酶后，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到最高，這與早熟禾和野大麥幼穗原生質(zhì)體分離條件[9.20]相似。

酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體分離的重要因素[9]。植物原生質(zhì)體分離的適宜酶解時(shí)間一般為2～12h ，不同植物或不同組織部位的最適酶解時(shí)間有所差異[13]，如杉木葉片為 3h^[21] 、黑枸杞葉片為 5h^[22] 、牡丹葉片為 6h^[23] 、棉花真葉為 9h^[24] 0在本試驗(yàn)中隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛筋草原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著增加（ Plt;0.05 ），其最優(yōu)酶解時(shí)間為³h ，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá) 5.0×10⁶ 個(gè)/g。但由于 ³h 為本試驗(yàn)設(shè)置的最長(zhǎng)酶解時(shí)間，因此若繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間至 或更長(zhǎng)，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量可能會(huì)更高。

在原生質(zhì)體分離過程中，離心速率對(duì)原生質(zhì)體的顯微形態(tài)、完整性和純化效果影響較大[16]史曉朋研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離心速率從 500r/min 增加到800r/min 后，甘蔗原生質(zhì)體產(chǎn)量大幅度增加，當(dāng)由800r/min 增加至 1200r/min 時(shí)，甘蔗原生質(zhì)體產(chǎn)量增加很少[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)離心速率從500r/min 提升到 1500r/min 時(shí)，牛筋草原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加（ Plt;0. 05 ）。當(dāng)離心速率從1500r/min 提升到 2500r/min 時(shí)，兩者的原生質(zhì)體數(shù)量無顯著差異。

植物的根、葉鞘、葉片、花粉、子葉等組織部位均能用于原生質(zhì)體制備[18，25-28]。植物幼嫩組織如幼葉、幼根、幼葉鞘等生長(zhǎng)狀態(tài)良好且具有較高的細(xì)胞分裂能力，一般能夠制備出高產(chǎn)量、高活力的原生質(zhì)體[29-30]。有研究表明，葉片含有大量的具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，葉片中的細(xì)胞易分解，酶解后能長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞形態(tài)，易于獲得生理狀況與遺傳學(xué)特性較為一致的原生質(zhì)體[31]，常作為植物原生質(zhì)體制備的首選組織材料[32]。安靜等研究發(fā)現(xiàn)，采用6～8葉期牛筋草的莖作為試驗(yàn)材料，酶解 ⁴h 后可得到形態(tài)較好的牛筋草原生質(zhì)體[33]。本研究以5～6葉期的牛筋草作為試驗(yàn)材料，酶解 ³h 后分別從牛筋草的葉片和葉鞘中分離出原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)用葉片制備的原生質(zhì)體細(xì)胞形態(tài)更好，產(chǎn)量和活力也略高于葉鞘。因此，相比于葉鞘，牛筋草葉片是制備原生質(zhì)體更為適宜的試驗(yàn)材料。

綜上所述，本研究以5～6葉期牛筋草葉片為材料，通過多個(gè)單因素試驗(yàn)對(duì)牛筋草原生質(zhì)體制備的組織部位、材料用量、離心速率、酶解條件等進(jìn)行篩選與優(yōu)化，分離制備出高質(zhì)量牛筋草原生質(zhì)體，建立了牛筋草葉片原生質(zhì)體分離體系。最適條件為： 2.0g 幼嫩的牛筋草葉片，在 10mL 由1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶組成的酶液中酶解 ^3h ，以 2 500r/min 的離心速率進(jìn)行純化，牛筋草原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá) 2.075×10⁷ 個(gè)/ ，活力為 90% 左右。本研究建立了高效制備牛筋草原生質(zhì)體的技術(shù)方法，可為后續(xù)從單細(xì)胞水平解析牛筋草等禾本科雜草的生物學(xué)特征、脅迫應(yīng)答、遺傳轉(zhuǎn)化等科學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]Deyell M，Ameta S，NgheP. Large scale control and programming ofgene expressionusing CRISPR[J].Seminars in Cell andDevelopmental Biology，2019，96：124-132.

[2]WangQ，Wu Y，PengAQ，etal.Single-cell transcriptome atlasrevealsdevelopmental trajectoriesand anovel metabolicpathwayofcatechin estersin tea leaves[J].Plant Biotechnology Journal，2022，20（11） ：2089-2106.

[3]Liu H，HuDX，Du PX，et al.Single-cell RNA-Seqdescribesthetranscriptome landscape and identifies critical transcriptionfactorsin the leaf blade of the alltetraploid peanut（ArachishypogaeaL.）[J]．PlantBiotechnologyJournal，2021，19（11）：2261 -2276.

[4]PanL，YuQ，HanHP，etal．Aldo-keto reductase metabolizesglyphosateand confersglyphosateresistance in Echinochloa colona[J].PlantPhysiology，2019，181（4）：1519-1534.

[5]ZhangC，Johnson N A，Hall N，et al.Subtelomeric5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthasecopy numbervariation confers glyphosate resistance in Eleusine indica[J].Nature Communications，2023，14：4865.

[6]安妍妍，張明惠，譚何新．單細(xì)胞測(cè)序在植物研究中的應(yīng)用[J].科學(xué)通報(bào)，2024，69（12）：1586-1597.

[7]JenesB，Pauk J.Plant regeneration fromprotoplastderived calli inrice（Oryza sativaL.）usingdicamba[J].Plant Science，1989，63（2）：187-198.

[8]Yoo SD，Cho Y H，Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts：aversatile cell system for transient gene expression analysis[J].NatureProtocols，2007，2：1565-1572.

[9]趙小強(qiáng).草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交[D]．蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10]唐然，彭小群，解新明．華南象草原生質(zhì)體分離及基因瞬時(shí)表達(dá)研究[J].草地學(xué)報(bào)，2015，23（3）：571-579.

[11]李志美，張碧佩，伍青，等.菊花花瓣原生質(zhì)體分離與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立[J].植物生理學(xué)報(bào)，2023，59（10）：1951-1963.

[12]張純，馮凱帆，郭文磊，等.廣東省稻菜輪作區(qū)中牛筋草對(duì)十種除草劑的抗性水平及靶基因序列分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2023，50（5）：1210-1218.

[13]張向歌，朱雅婧，陸莉莉，等.油莎豆原生質(zhì)體制備的組織篩選及條件優(yōu)化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，52（12）：49-56.

[14]彭小群，唐然，解新明.禾本科植物原生質(zhì)體分離研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（1）：252-257.

[15]王莉，姚占軍.植物原生質(zhì)體的制備與活力檢測(cè)研究進(jìn)展[J]．生物技術(shù)通報(bào)，2009（增刊）：46-50.

[16]史曉朋.甘蔗原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)體系的建立和優(yōu)化[D].南寧：廣西大學(xué)，2017.

[17]CondeP，SantosC.Anefficientprotocol forUlmusminorMill.protoplast isolation and culture inagarose droplets[J].Plant CellTissueamp;Organ Culture，2006，86：359-366.

[18]喬永旭，張永平，王桂蘭，等.蝴蝶蘭原生質(zhì)體提取方法的優(yōu)化[J].植物生理學(xué)通訊，2008，44（6）：1177-1180.

[19]郭艷萍．玉米胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體的分離與流式純化[D]．咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[20]李彥舫，程肖蕊，張亞蘭，等.野大麥幼穗原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)［J].植物學(xué)通報(bào)，1999（1）：68-72.

[21]唐佳妮，林二培，黃華宏，等.杉木葉片原生質(zhì)體分離及RNA提取體系的建立[J].林業(yè)科學(xué)，2018，54（4）：38-48.

[22]高思丹.枸杞原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)研究[D].西寧：青海大學(xué)，2020.

[23]于相麗，李勇慧，李業(yè).牡丹葉片原生質(zhì)體分離條件的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：122-125.

[24]李青，魚海鵬，張子豪，等．棉花真葉原生質(zhì)體分離及瞬時(shí)表達(dá)體系的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（21）：4514-4524.

[25]康潔.豐香和紅顏草莓原生質(zhì)體提取與細(xì)胞融合的條件優(yōu)化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：58-61.

[26]邸宏，盧翠華，陳伊里．馬鈴薯葉片原生質(zhì)體的游離純化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（6）：11-13.

[27]王蒂，司懷軍，王清.馬鈴薯花粉原生質(zhì)體分離的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1999（5）：323-326.

[28]房江育．馬鈴薯試管苗愈傷組織的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)［J]．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（1）：59-62.

[29]陳愛萍，劉慧敏，李瑤，等.‘新牧4號(hào)'紫花苜蓿原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)因素的研究[J]．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（1）：137 -141.

[30]Revilla MA，Ochatt SJ，DoughtyS，etal.A general strategy fortheisolationofmesophyll protoplasts from deciduous fruit and nuttreespecies[J].Plant Science，1987，50（2）：133-137.

[31]趙昊，周曉晴，馬遇樂，等．甘薯葉片原生質(zhì)體快速制備方法的優(yōu)化[J]．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2023，40（4） ：283 -287.

[32]宮芳芳．馬鈴薯原生質(zhì)體的提取及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[D]．合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

[33]安靜，陳勇，羅淋勝，等．牛筋草原生質(zhì)體提取及轉(zhuǎn)化方法：CN118755655A[P]. 2024-10-11.