MSCs廣泛分布于人體多種組織中，如骨髓、脂肪組織、牙髓、皮膚成纖維細(xì)胞等[1-2]。脂肪組織因易獲得、采集便捷以及對供體影響小等優(yōu)勢，近年來成為研究熱點(diǎn)，是獲取MSCs的理想來源。在臨床實(shí)踐中，MSCs已有效支持造血干細(xì)胞移植，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，提高移植成功率。同時，MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，有助于修復(fù)損傷組織[3]。對于自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病和炎癥性腸病等，同樣展現(xiàn)出了顯著的療效。特別是在治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（OA）方面，因其能夠分化為軟骨細(xì)胞并有效控制關(guān)節(jié)炎癥，成為研究的一大焦點(diǎn)。盡管MSCs在臨床治療中表現(xiàn)出了巨大的潛力，但關(guān)于其制劑穩(wěn)定性的研究仍需進(jìn)一步深入。

1.2材料

1.2.1 試劑及設(shè)備

1材料與方法

1.1 概述

遵循國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心在2023年發(fā)布的《人源干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[4]，穩(wěn)定性研究已成為一項(xiàng)必要工作，內(nèi)容包括代表性原液、成品和需要臨時或階段性凍存的工藝中間品[5]。在進(jìn)行研究時，應(yīng)當(dāng)參照生物制品穩(wěn)定性研究的技術(shù)規(guī)范，如 ICHQ5C 指南。鑒于制劑的有效成分是活細(xì)胞，儲存過程中的溫度、時間及條件變化均可能對制劑的質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，包括細(xì)胞的狀態(tài)、數(shù)量、活率、表面標(biāo)記以及生物學(xué)活性等。在本研究中，對制劑在 2～8°C 儲存條件下不同儲存時間的穩(wěn)定性進(jìn)行了詳細(xì)考察，旨在確保細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的性能達(dá)標(biāo)，為MSCs的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

培養(yǎng)基（SCM015，默克公司）、人血白蛋白（華蘭生物）、復(fù)方電解質(zhì)注射液（四川科倫藥業(yè)）、DMSO（默克公司）、 .0.1% 明膠溶液（默克公司）、胰蛋白酶-EDTA消化液（默克公司）、T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶（無錫耐思生物科技）、細(xì)胞計(jì)數(shù)器/細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Nexcelom）、流式細(xì)胞儀（BD公司）、顯微鏡（徠卡）。

1.2.2 細(xì)胞建庫

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離與培養(yǎng)：在無菌條件下，將脂肪組織經(jīng) 70μm 濾網(wǎng)去除雜質(zhì)，離心收集細(xì)胞懸液。利用AOPI熒光計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞密度，在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行初培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基以促進(jìn)貼壁生長。之后，將細(xì)胞重懸于添加FGF-2的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，接種于預(yù)處理板，在 環(huán)境中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞融合度至 80% 時，用胰蛋白酶-EDTA消化，按需密度接種新板，繼續(xù)擴(kuò)增或凍存，進(jìn)行5次傳代建立細(xì)胞庫。

1.2.3 制劑和穩(wěn)定性研究

取凍存細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇，采用 37^°C 水浴恢復(fù)細(xì)胞活力。在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，應(yīng)呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣形態(tài)（紡錘形和梭形）貼壁生長，形態(tài)均一。在復(fù)蘇時，細(xì)胞經(jīng)NaCl注射液洗滌，離心去除凍存保護(hù)劑。熒光計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞重懸于 0.5%～1.0% 人血白蛋白的復(fù)方電解質(zhì)注射液中，調(diào)整細(xì)胞終濃度為 1.0×10⁷cells/mL_?

將制劑儲存在 冰箱中，以模擬臨床儲存條件。分別在 _0，6，9h 取樣，進(jìn)行包括外觀、無菌、pH 及細(xì)胞功能（成脂、成骨分化）的檢測，以及細(xì)胞數(shù)量、活率和表型（CD90、CD105、CD73陽性，CD34、CD45陰性），并檢測其免疫調(diào)節(jié)功能。以評估在0.5%～1.0% 人血白蛋白復(fù)方電解質(zhì)注射液保護(hù)下細(xì)胞功能與活性。

1.3 檢測方法

外觀檢查：目視法，為澄清乳白色液體，無明顯 可見細(xì)胞聚團(tuán)，與初始外觀相比無明顯變化。

無菌檢測：按《中華人民共和國藥典》2020年第三部“薄膜過濾法\"進(jìn)行無菌檢查。結(jié)果應(yīng)為陰性。

細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率：采用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，活率不低于 80% 。

成骨分化：茜素紅染色，顯微鏡觀察呈現(xiàn)深紅色。

成脂分化：油紅0染色，顯微鏡下觀察呈現(xiàn)紅色。

流式表型：流式分析，陽性標(biāo)記CD73、CD90、CD105表達(dá)應(yīng) ?95.0% 。

淋巴細(xì)胞增殖抑制：流式分析，抑制率應(yīng) ≥25% 。

2結(jié)果

三批制劑 2～8°C 不同時間節(jié)點(diǎn)的結(jié)果詳見表1。

三批次細(xì)胞在 2～8°C 儲存后，初始活率近100% ，顯示良好起始狀態(tài)。隨時間推移，各批次活率雖有下降，但最高僅降 3.11% ，仍保持高活性（圖1a）。細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，無菌且形態(tài)正常，具備成骨與成脂分化能力，均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，表明儲存條件有效維護(hù)了細(xì)胞性能，適合進(jìn)一步研究。

（a）細(xì)胞活率；（b）CD34、CD45表達(dá)率；（c）淋巴細(xì)胞增殖抑制；（d）CD73表達(dá)率

三個批次MSCs在0、6、9h檢測中，CD34與CD45表達(dá)極低且無顯著變化，表明細(xì)胞未分化為造血細(xì)胞，維持了原細(xì)胞特性（圖1b）。同時，CD73、CD90、CD105等特異性標(biāo)記物表達(dá)穩(wěn)定，尤其是CD73與CD90，CD105雖有波動但總體一致，顯示 MSCs純度和生物學(xué)活性得以保持（圖1d）。此外，MSCs顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖，且隨時間延長抑制率略增，暗示其免疫調(diào)節(jié)功能可能有所增強(qiáng)，具體機(jī)制待深入探究（圖1c）。

綜上，三批次MSCs（MSC-P001、MSC-P002、MSC-P003）在 2～8% 下，細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，活率超 80% ，表面標(biāo)記CD73、CD90、CD105高表達(dá)（ （gt;95% ），CD34、CD45低表達(dá)，符合ISCT標(biāo)準(zhǔn)。同時，細(xì)胞具備成骨、成脂分化能力及高淋巴細(xì)胞增殖抑制率，顯示其良好的分化與免疫調(diào)節(jié)功能。

3討論

MSCs穩(wěn)定性研究是明確其藥品儲存條件與有效期的基礎(chǔ)，細(xì)胞生物學(xué)活性直接影響臨床應(yīng)用效果。本研究采用含 0.5%～1.0% 人血白蛋白的復(fù)方電解質(zhì)注射液作為保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)三批次MSCs在體外保存 ^9h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。盡管活性略有下降，但關(guān)鍵表面標(biāo)記物CD73、CD90、CD105高表達(dá)，且淋巴細(xì)胞增殖抑制能力持續(xù)，支持臨床即時應(yīng)用。然而，保存條件對MSCs活性影響顯著，未來需深入探索不同條件（溫度、培養(yǎng)基、氣體環(huán)境）下的穩(wěn)定性，以優(yōu)化保存方法，延長保存期限。在細(xì)胞制劑開發(fā)過程中，需全面考察儲存、運(yùn)輸、使用的穩(wěn)定性，確保臨床應(yīng)用安全，為臨床轉(zhuǎn)化奠定堅(jiān)實(shí)的科學(xué)和技術(shù)基礎(chǔ)

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