摘要：為研究導(dǎo)致河南省某養(yǎng)殖場大口黑鱸皮膚潰爛并死亡的病因并從中分離優(yōu)勢感染菌株，從中獲取大口黑鱸爆發(fā)該病的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，達(dá)到預(yù)防與治療的的目的。首先通過顯微鏡觀察和分子生物學(xué)等手段排除寄生蟲病和病毒感染的可能性，排除之后在患病大口黑鱸的肝臟和脾臟中，分離出1株優(yōu)勢菌株NY22101804，經(jīng)過形態(tài)觀察與通過生理生化試驗(yàn)分析和檢測菌液16S rDNA基因序列并比對構(gòu)建進(jìn)化樹分析，確認(rèn)菌株類型，再通過人工回歸感染試驗(yàn)驗(yàn)證致病性并通過紙片擴(kuò)散法和牛津杯法測定了該菌對抗生素和中藥單體的藥物敏感性對藥物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，該菌為銅綠假單胞菌株，通過人工回感試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NY22101804對大口黑鱸具有急性致死效應(yīng)，死亡率與濃度有依賴性呈正相關(guān)變化，通過藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，菌液對妥布霉素、四環(huán)素等10種抗生素敏感，對青霉素、氨卡西林等9種抗生素具有耐藥性，在中藥單體的測試中，黃芩素表現(xiàn)出最好的抑菌效果，其他如黃芩苷、柚皮素、蕓香苷等也顯示出不同程度的抑菌活性。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸；銅綠假單胞菌；藥物敏感性；16S rRNA；中藥單體

中圖分類號：S941.4""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0231-06

大口黑鱸是一種目前國內(nèi)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖優(yōu)勢品種之一，特點(diǎn)鮮明，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、成熟體型大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高昂的優(yōu)勢，被我國的商家漁戶重點(diǎn)看待，年產(chǎn)量逐年上升^［1］。大口黑鱸于20世紀(jì)80年代引進(jìn)我國，在經(jīng)濟(jì)價(jià)值與食用價(jià)值上地位越來越明顯，在高端餐飲和海鮮市場上有著廣闊的前景^［2］。大口黑鱸以其鮮美的肉質(zhì)和高蛋白的優(yōu)點(diǎn)，受到廣大食客與消費(fèi)者的歡迎，經(jīng)濟(jì)價(jià)值潛力巨大，而且大口黑鱸抗病力強(qiáng)，病害少，在池中可單養(yǎng)或魚塘中混養(yǎng)，也可在網(wǎng)箱中高密度養(yǎng)殖，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益較高。2022年我國淡水鱸魚養(yǎng)殖量達(dá)到80.25萬t，相比于2021年的70.21萬t，總產(chǎn)量增加了14.3%，成為國內(nèi)養(yǎng)殖數(shù)量巨大的淡水魚種之一^［3］。然而，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷完善進(jìn)步，養(yǎng)殖密度變大，微生物繁殖迅速，伴隨著大口黑鱸魚體內(nèi)的病害也逐漸增長。研究表明，導(dǎo)致大口黑鱸病害的病原主要包括細(xì)菌?。ㄖZ卡氏菌、嗜水氣單胞菌等）、病毒?。ㄈ绾绮什《尽棤畈《镜龋?、寄生蟲?。ㄈ畿囕喯x、杯體蟲等）^［4］。銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界，是土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一，也是一種人獸共患的革蘭氏陰性桿菌，而水上養(yǎng)殖中，目前有在草魚及錦鯉等魚類中分離到銅綠假單胞菌^［5-6］，在大口黑鱸中沒有分離到該菌株。

近期，河南省南陽市某養(yǎng)殖場的大口黑鱸出現(xiàn)暴發(fā)式死亡病害，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，主要癥狀為：魚體皮膚潰瘍、腹部腫大發(fā)紅，為了研究病因，對其病原進(jìn)行分離鑒定，本研究在患病大口黑鱸脾臟組織中分離純化到1株細(xì)菌，通過生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析鑒定為銅綠假單胞菌。對該病原菌進(jìn)行了抗生素和天然小分子藥物篩選，以期為大口黑鱸預(yù)防銅綠假單胞菌細(xì)菌病提供參考依據(jù)。

1"材料與方法

本試驗(yàn)于2022年4—11月于南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院中英聯(lián)合試驗(yàn)室完成。

1.1"試驗(yàn)材料

患病大口黑鱸魚5尾，來自河南省某大口黑鱸養(yǎng)殖場。用于試驗(yàn)的健康大口黑鱸魚苗120尾，購自河南省南陽市某大口黑鱸魚苗場，體重（5.0±1.0） g，水溫22～25 ℃，每日投喂基礎(chǔ)飼料1次，換1次水，暫養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)前，隨機(jī)抽取 5%的魚苗，取肝和脾組織進(jìn)行無菌研磨后，在LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂盤子，在 28 ℃ 下孵育24～48 h，確保無細(xì)菌從動物樣本中檢測到。

1.2"主要試劑和儀器

ApexHF HS DNA 聚合酶預(yù)混液-FS（含染料）（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；無菌PBS［磷酸鹽緩沖液，生工生物工程（上海）股份有限公司］；Biospin病毒DNA/RNA提取試劑盒（北京華新康信生物科技有限公司）；抗生素藥敏片、生理生化管試劑（杭州微生物試劑有限公司）；中藥單體（上海麥克林生化科技股份有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡［舜宇光學(xué)科技 （集團(tuán)）有限公司］；電動研磨器、高壓蒸汽滅菌鍋（廣州科曉科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（廣州沃霖實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；PCR 儀（美國 Bio-Rad 公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠紫外成像分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；微量移液器和多道移液器、微型離心管、一次性培養(yǎng)皿等［生工生物工程（上海）股份有限公司］。引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3"病毒及寄生蟲檢測

使用無菌剪剪下患病鱸魚體表腐爛組織，與剪下的魚鰓部位進(jìn)行壓片，用光學(xué)顯微鏡下觀察有無寄生蟲狀況。取病魚腐爛位置和肝組織，無菌PBS研磨后，用Biospin病毒DNA/RNA 提取試劑盒進(jìn)行病毒DNA和RNA 的提取，提取產(chǎn)物分為2份，1份直接用于大口黑鱸虹彩病毒檢測，另外1份進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用特異性引物，分別利用DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測大口黑鱸虹彩病毒和彈狀病毒。PCR反應(yīng)體系為：rTaq mix預(yù)混液（2×）5 μL，上、下游引物L(fēng)MBVRTF4/LMBVRTR4（表1）各0.5 μL，超純水 3 μL，DNA "1 μL。另一份提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行大口黑鱸彈狀病毒的檢測，PCR反應(yīng)體系為rTap mix（2×）5 μL，上、下游引物SCRVRTF4/SCRVRTR4（表1）各0.5 μL，超純水 3 μL，cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性階段95 ℃、5 min；變性階段95 ℃、30 s，退火階段56 ℃、30 s，延伸階段72 ℃、30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃、5 min。產(chǎn)物通過1%瓊脂糖電泳鑒定，確定是否為病毒感染。

1.4"細(xì)菌分離純化

75%醫(yī)用乙醇進(jìn)行魚體皮膚處理后，取病魚體皮膚潰爛處的潰爛組織，之后使用無菌剪沿肚臍剖開腹部，用無菌剪刀、鑷子取出肝臟、脾臟組織放入無菌1.5 mL EP管中，之后加入200 μL無菌PBS進(jìn)行研磨處理后，對研磨液用PBS進(jìn)行10倍稀釋，將稀釋好的組織液使用涂布器均勻的涂布在LB固體平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)14～18 h。觀察分離細(xì)菌的菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行3次劃線分離純化，觀察細(xì)胞的形態(tài)，并對純化后的菌株LB液體培養(yǎng)基搖至對數(shù)生長期后，同50%丙三醇保種，甘油保菌獲得純培養(yǎng)的菌株NY22101804。

1.5"16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用16S rRNA通用引物27F/1492R（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）包括：ApexHF HS DNA Master Mix 12.5 μL，引物27F/1492R分別加入1 μL，超純水9 μL，NY22101804菌液作為模板1.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性階段98 ℃、30 s；變性階段98 ℃、10 s，退火階段56 ℃、15 s，延伸階段72 ℃、20 s，30個循環(huán)；之后72 ℃、10 min結(jié)束PCR反應(yīng)。在電泳儀上進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測，將樣品送至上海生工生物工程有限公司（鄭州）進(jìn)行16S rRNA基因測序。將測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸BLAST序列比對，采用Cluxal和MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)置為500。

1.6"生理生化特性

在超凈臺中無菌條件下用接種棒挑取菌液接種于微生物生化鑒定管中，進(jìn)行生理生化特性鑒定試驗(yàn)。按照試劑盒說明書接種后鑒定管于35 ℃溫度下恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。將獲得的菌株生理生化特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、試劑盒說明書中標(biāo)準(zhǔn)菌株的結(jié)果作對比來初步判定菌株屬種。

1.7"細(xì)菌人工回歸感染試驗(yàn)

將分離純化得到的銅綠假單胞菌NY22101804接種于液體LB培養(yǎng)基中，以28 ℃在搖床搖菌 12 h，之后以8 000 r/min離心10 min，用無菌PBS清洗3遍，并使用分光光度計(jì)將菌懸液吸光度D600 nm調(diào)整為1，此時(shí)細(xì)菌懸液的濃度為1×10⁹"CFU/mL，利用10倍稀釋法，利用無菌PBS分別稀釋成1×10⁹～1×10⁵"CFU/mL這5種濃度。通過腹腔注射感染鱸魚，每組感染20尾健康鱸魚，每尾魚注射劑量為100 μL菌懸液，并取20尾健康的大口黑鱸注射100 μL的無菌PBS作為對照。每日早晚觀察記錄試驗(yàn)鱸魚的患病癥狀和死亡數(shù)量，正常早晚2次喂食，及時(shí)清理魚缸，持續(xù)7 d。

1.8"藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，取對數(shù)生長期的菌液，使用分光光度計(jì)將菌懸液吸光度D600 nm調(diào)整為1，利用10倍稀釋法，將菌懸液濃度稀釋為1×10⁸"CFU/mL，取100 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，之后用無菌鑷子順時(shí)針依次貼入試劑盒中的藥敏紙片，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，使用游標(biāo)卡尺測量處理組與對照組的抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小，參考《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》說明，判定菌株對不同抗生素的敏感性。

1.9"中藥單體抑菌研究

選用牛津杯法對26種不同的中藥單體進(jìn)行病原菌抑菌研究，取對數(shù)生長期的菌液，使用分光光度計(jì)將菌懸液吸光度D600 nm調(diào)整為1，利用10倍稀釋法，將菌懸液稀釋為1×10⁸"CFU/mL的濃度，取100 μL菌懸液均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基上。在超凈臺中使用鑷子把牛津杯輕輕安置于涂布好的培養(yǎng)基表面并按照順時(shí)針標(biāo)記放置，然后分別向牛津杯中加50 μL濃度為10 mg/mL的中藥單體溶劑作為試驗(yàn)組，用二甲基亞砜（DMSO）與H2O作為對照組，分別對應(yīng)做好標(biāo)記。在28 ℃培養(yǎng)箱中正置平板24 h后，之后使用游標(biāo)卡尺測定對應(yīng)抑菌圈范圍，以抑菌圈直徑大小來判定中藥單體對病原菌的敏感程度。

2"結(jié)果與分析

2.1"病原檢測結(jié)果

患病的大口黑鱸腹部腫大發(fā)紅、魚體皮膚潰瘍癥狀，解剖后可見肝臟與脾臟顯著腫大，顯微鏡檢測沒有寄生蟲，通過PCR擴(kuò)增檢測大口黑鱸虹彩病毒（圖1左）與彈狀病毒（圖1右），結(jié)果為陰性，說明病原也不是病毒感染，對其進(jìn)行細(xì)菌分離發(fā)現(xiàn)，菌株單一感染。推測該大口黑鱸養(yǎng)殖基地患病魚病原是細(xì)菌感染引起的。

2.2"病原菌分離純化及生理生化特性

從患病大口黑鱸潰爛部位以及肝臟和脾臟組織中，分離出優(yōu)勢菌株，將菌株命名為NY22101804。該菌在LB固體培養(yǎng)基上觀察到形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則圓形，邊緣規(guī)整呈毛絮狀，菌落表面飽滿顆粒，菌落呈現(xiàn)乳白色非透明顏色（圖2）。通過生理生化試驗(yàn)對菌株NY22101804的研究，結(jié)果（表2）顯示：與精氨酸、鳥氨酸、尿素、枸櫞酸鹽、葡萄糖等反應(yīng)為陽性；與賴氨酸、七葉苷、β-半乳糖苷（ONPG）、硝酸鹽還原、蛋白胨水、硫化氫、麥芽糖、木糖、蔗糖等反應(yīng)為陰性，并與參考已分離的銅綠假單胞菌作比較，結(jié)果一致，符合銅綠假單胞菌的生化鑒定特佂，符合初步判斷。

2.3"16S rRNA序列分析

利用通用引物27F和1492R擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因片段，擴(kuò)增獲得1 500 bp左右的基因序列（圖3），送上海生工生物有限公司（鄭州）測序后，NCBI網(wǎng)站選擇進(jìn)行核酸BLAST序列比對，NY22101804同銅綠假單胞菌XZPG11株（HQ844508.1）的16S rRNA序列的同源性達(dá)到99.72%，針對16S rRNA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示，新分離的NY22101804菌株與銅綠假單胞菌參考菌株的親緣關(guān)系最近（圖4），綜合考慮，本研究中分離的NY22101804細(xì)菌鑒定為為銅綠假單胞菌。

2.4"人工回感試驗(yàn)

將分離純化的NY22101804進(jìn)行不同濃度稀釋后，人工回感大口黑鱸魚苗，試驗(yàn)感染的大口黑鱸魚體腹部腫大發(fā)炎，體表局部發(fā)炎、鰓部發(fā)紅，與采取病料魚體癥狀相似，魚體注射菌懸液1周后觀察發(fā)現(xiàn)，向魚體攻毒注射劑量為1×10⁸"CFU/尾與 1×10⁷"CFU/尾處理死亡率較高，分別為100%與80%（表3），感染后發(fā)病速度快，大多發(fā)生在48 h內(nèi)的急性期死亡，對照組無死亡、無癥狀。從發(fā)病大口黑鱸的肝脾中分離純化細(xì)菌，鑒定為銅綠假單胞菌。

2.5"抗生素的藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，參照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試劑判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定銅綠假單胞菌對24種抗生素的敏感程度，結(jié)果顯示，分離株NY22101804對頭孢他啶、呋喃妥因、諾氟沙星等抗生素敏感，對頭孢噻肟、鏈霉素等這一類抗生素中度敏感，對青霉素、呋喃唑酮、利福平等抗生素具有耐藥性，具體數(shù)據(jù)大小及標(biāo)準(zhǔn)見表4。

2.6"中藥單體抑菌試驗(yàn)

使用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑大小并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以抑菌圈直徑來判定26種中藥單體對病原菌的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥單體對NY22101804有不同程度的抑菌作用，其中黃芩素對NY22101804的抑菌效果最好，黃芩苷、芹菜酚、芝麻素、山柰酚、桑黃素、姜黃素、柚皮素、蕓香苷、水飛薊素、漆黃素、茶多酚、鞣花酸、香芹酚均有不同程度的抑菌作用，大黃素、綠原酸、原花青素、水飛薊賓、白藜蘆醇、甘草次酸、甘草酸、沒食子酸、木樨草素、異丁香酚、丁香酚、厚樸酚沒有抑菌效果（表5）。

3"結(jié)論與討論

隨著大口黑鱸養(yǎng)殖體量地不斷增大，發(fā)揮著越來越大的經(jīng)濟(jì)潛力，但越來越頻繁的傳染病，尤其是細(xì)菌性疾病的暴發(fā)及其并發(fā)癥，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌性疾病傳播速度快，死亡率高，有必要對致病細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，從而研究其對魚類健康的影響^［10］。通過16S rRNA 分子標(biāo)記來鑒定細(xì)菌分類是一種很有效的方法^［11］。本研究利用分離株的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST分析比對，結(jié)果顯示與NCBI數(shù)據(jù)庫中銅綠假單胞菌的一致性為99.72%，此外，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹再次驗(yàn)證了分離株為銅綠假單胞菌。利用人工回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NY22101804菌株具有急性致死作用，當(dāng)注射劑量為1×10⁸"CFU/尾濃度下，1 d后死亡率達(dá)到100%，在1×10⁷"CFU/尾濃度下，48 h死亡率達(dá)到50%，96 h死亡率達(dá)到80%。并且試驗(yàn)組魚發(fā)病情況與自然發(fā)病癥狀基本相同，體表發(fā)炎紅腫，腹部最為嚴(yán)重，從人工感染的病魚肝脾分離到與初次分離的NY22101804菌株形態(tài)相似，鑒定為同一株，可以表明銅綠假單胞菌為致病菌株，對大口黑鱸養(yǎng)殖具有潛在威脅作用。

目前，抗生素治療因其應(yīng)用廣泛、種類多、見效快，仍然是對抗病害的第一選擇，而對于抗生素的使用也在標(biāo)準(zhǔn)化、合理化、科學(xué)化。為了使該菌的用藥更為合理，不再盲目用藥，以減少環(huán)境污染以及魚體傷亡，本研究發(fā)現(xiàn)NY22101804對頭孢他啶、慶大霉素等抗生素敏感，這些藥物在進(jìn)行水產(chǎn)病害精準(zhǔn)用藥過程中發(fā)揮著重要作用。然而，長期過度使用抗生素不僅會留下殘留物，還會導(dǎo)致抗生素耐藥菌（ARB）和抗生素耐藥基因（ARGs）的產(chǎn)生^［12］，許多水生細(xì)菌病原體產(chǎn)生了多種抗生素耐藥性，其中楊雪瓊等提到MDRPA（多重耐藥銅綠假單胞菌）對于青霉素、紅霉素、頭孢唑啉、氨卡西林這些抗生素的耐藥率達(dá)到了100%，其他抗生素也有不同程度的耐藥率^［13］。本研究發(fā)現(xiàn)的菌株NY22101804銅綠假單胞菌對青霉素等抗生素具有耐藥作用，隨著抗生素耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，如何使用非抗藥物進(jìn)行細(xì)菌防控愈發(fā)重要。

草本植物是藥用化合物和天然抗菌物質(zhì)的重要來源^［14］，由于草藥及其提取物的有效性、安全性、環(huán)境友好性和耐藥性較低等特點(diǎn)，可用于治療許多難以使用化學(xué)藥物和抗生素治療的病毒性、細(xì)菌性和代謝性疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的預(yù)防上展現(xiàn)環(huán)保潛力，成為越來越有前途的補(bǔ)充劑和替代品。中草藥在魚類疾病防治中的應(yīng)用主要是由于其有效成分包括多酚、多糖、皂苷、黃酮、生物堿、精油等具有強(qiáng)大的免疫增強(qiáng)和抗氧化等作用，具有抗嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、柱狀黃桿菌、鰻弧菌等多種水產(chǎn)病原細(xì)菌^［15-16］，因此，中藥在抑制病原菌方面的重要性日益增加。

本研究采用瓊脂擴(kuò)散法選用具有抑菌作用的多種中藥單體進(jìn)行體外抗菌效果篩選，其中包括黃芩素、黃芩苷、芹菜酚、芝麻素、山柰酚、桑黃素、姜黃素、柚皮素、蕓香苷、水飛薊素、漆黃素、茶多酚、鞣花酸、香芹酚具有體外抑菌活性，其中以黃芩素的抑菌效果最佳。這為未來下一步中藥治療這類細(xì)菌病提供了理論基礎(chǔ)。鑒于大多數(shù)草藥產(chǎn)品的療效和安全性評估是基于臨床結(jié)果而不是體外測評，還需要詳細(xì)的體內(nèi)動物研究和臨床試驗(yàn)來確定其臨床效用。

綜上所述，本研究從患病大口黑鱸中分離鑒定到1株銅綠假單胞菌，分別對其進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)和中藥單體抑菌作用檢測，為水產(chǎn)養(yǎng)殖使用抗生素精準(zhǔn)施治抑制病害提供參考的意見。此外，考慮到傳統(tǒng)草藥提取物比化學(xué)物質(zhì)更環(huán)保，與抗生素相比，可以提供更可持續(xù)的治療，黃芩素和其他一些抗菌中藥單體有可能是未來控制銅綠假單胞菌的候選藥物，為下一步的綠色用藥提供理論依據(jù)。

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