摘要：從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）根際土壤中篩選出1株耐銻根際促生菌A-73-1，對該菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，分析該菌株在銻脅迫下的潛在促生能力，同時(shí)通過種子萌發(fā)試驗(yàn)，探究銻脅迫下該菌株對油菜種子萌發(fā)的影響。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列測序，鑒定該菌株為好氧革蘭氏陰性菌，屬貪銅菌 （Cupriavidus metalliduran）。 菌株IAA產(chǎn)量最高為93.33 μg/mL；在243.52 mg/L銻脅迫下，最大無機(jī)溶磷量為 445.61 μg/mL，ACC脫氨酶產(chǎn)量最高為0.047 86 U/mg。在不同濃度銻（20、40、60 mg/L）脅迫下觀察油菜種子的萌發(fā)結(jié)果，與對照組（不加銻）相比，接種 A-73-1后，幼苗的根長、莖長、鮮重、干重等生物量指標(biāo)均顯著提升，根系抗氧化酶活性顯著提升，丙二醛含量降低；種子萌發(fā)后根、莖、葉的銻含量顯著降低，尤其是在60 mg/L銻脅迫下，分別降低42.97%、48.36%、77.99%。菌株A-73-1有優(yōu)良的促生能力，并能提高銻脅迫下油菜幼苗的抗逆性，期待本研究結(jié)果可以為進(jìn)一步研發(fā)耐銻促生菌劑修復(fù)銻污染土壤提供理論依據(jù)，同時(shí)為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的修復(fù)策略提供潛在解決方案。

關(guān)鍵詞：銻脅迫；耐銻根際促生菌A-73-1；促生特性；油菜種子萌發(fā)

中圖分類號：S634.304；S182；X53""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0262-09

銻（antimony，Sb）是一種有毒的類金屬，世界衛(wèi)生組織規(guī)定，土壤中銻的最大允許含量為36 mg/kg，而我國許多地區(qū)土壤銻的含量遠(yuǎn)超規(guī)定含量^［1-2］。莫昌琍等發(fā)現(xiàn)，在貴州省獨(dú)山礦區(qū)周邊的農(nóng)用地上，銻含量達(dá)到220.80 mg/kg^［3］。陳秋平等對貴州省晴隆銻礦區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦區(qū)農(nóng)田土壤中的平均銻含量達(dá)到71.65 mg/kg^［4］。湖南省錫礦山礦區(qū)周邊的土壤中，銻含量高達(dá)6 946 mg/kg，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐闹参锷L和人們的身體健康^［5-6］。湖南省農(nóng)田銻污染被認(rèn)為是亟待解決的重要生態(tài)環(huán)境問題。2022年3月，生態(tài)環(huán)境部印發(fā)的《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)重金屬污染防控的意見》中，首次將銻列為重點(diǎn)防控的類金屬污染物^［7］。近年來，對土壤銻的相關(guān)研究工作也陸續(xù)展開，主要圍繞銻對動(dòng)植物的毒性以及在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化，但針對農(nóng)田銻污染的修復(fù)工作比較缺乏。目前，對土壤重金屬的修復(fù)方法主要有物理化學(xué)法^［8-9］、生物修復(fù)法^［10-11］，但均存在處理成本高、修復(fù)方法較單一等問題，大多數(shù)無法實(shí)現(xiàn)農(nóng)田重金屬污染的“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”策略。

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是我國種植面積最廣的油料作物，其中湖南省是種植面積最大的省份^［12］。甘藍(lán)型油菜以“稻油”輪作為主，對鎘、銅、鋅等重金屬具有較強(qiáng)的富集能力，其籽粒中重金屬的富集量比根、莖、葉中低^［13-15］。因此，甘藍(lán)型油菜較適宜于在重金屬污染的農(nóng)田種植且能保持其原有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可認(rèn)為其具備綠色可持續(xù)修復(fù)所需的關(guān)鍵特質(zhì)。但目前有關(guān)油菜用于銻污染農(nóng)田修復(fù)的研究非常缺乏。

根際促生菌 （plant growth-promoting rhizobacterica，PGPR） 是一類存活于土壤中或者定殖于植物根際、根表、根內(nèi)或植物莖葉內(nèi)的，可以促進(jìn)植物生長、增加作物產(chǎn)量或者拮抗植物病原微生物、防治作物病害的一系列細(xì)菌的統(tǒng)稱^［16-18］。已有研究證明，在重金屬污染環(huán)境中，一些耐受重金屬的PGPR能通過抑制重金屬的活性而降低農(nóng)作物對重金屬的吸收量，同時(shí)保證糧食的安全生產(chǎn)。Pramanik等分離得到1株對重金屬鎘具有抗性的PGPR菌株K6，制成菌液后灌溉被鎘污染的水稻根際土壤，發(fā)現(xiàn)K6菌株對水稻幼苗具有一定的抗鎘能力，同時(shí)能促進(jìn)水稻根系的生長^［19］。Liaquat等發(fā)現(xiàn)，在28.10 mg/L的鎘濃度下，嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）處理后的辣椒種子根系長度是未處理辣椒種子的1.46倍，該菌具有較強(qiáng)的金屬耐受性和對鎘的生物修復(fù)潛力^［20］。利用PGPR作為微生物修復(fù)劑，強(qiáng)化油菜生長從而修復(fù)銻污染農(nóng)田土壤，是一種非常有前景的綠色修復(fù)策略。

本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥［Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara］的根際土壤中分離、篩選、鑒定得到1株耐銻能力較強(qiáng)的促生菌，研究其生理生化特性。植物種子的萌發(fā)影響植物的整個(gè)生長周期，萌發(fā)后的幼苗比植物更容易受到金屬毒性的影響。本研究分析銻脅迫下，油菜種子萌發(fā)后其幼苗的生長特性及根系的抗氧化酶活性等相關(guān)指標(biāo)，以期為利用耐銻PGPR與油菜聯(lián)合修復(fù)銻污染農(nóng)田土壤提供可行方案和理論依據(jù)，同時(shí)為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的修復(fù)策略提供潛在的解決方案。

1"材料與方法

1.1"供試材料

試驗(yàn)于2020年7月在湖南省婁底市湖南人文科技學(xué)院進(jìn)行。

供試土壤：于婁底市冷水江市（27°30′49″～27°50′38″N，111°18′57′～111°36′40″E）錫礦山地區(qū)，采用5點(diǎn)取樣法，采集125份土樣，均裝入無菌采樣袋，標(biāo)注地理坐標(biāo)，帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰柜中保存^［21］。

供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基^［22］、CDM培養(yǎng)基^［23］、無機(jī)磷（PKO）液體培養(yǎng)基^［24］。

供試油菜種子：甘藍(lán)型油菜婁文油98種子，由湖南省婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

不同濃度銻（Sb Ⅲ）溶液由半水合酒石酸銻鉀（C4H4KO7Sb·1/2H2O）分析純配制。

1.2"試驗(yàn)方法

1.2.1"菌株篩選分離

取根際土壤懸液，梯度稀釋至10^-3涂布于LB平板，28 ℃ 培養(yǎng)2～4 d后，挑取不同菌落置于LB培養(yǎng)基上劃線純化，暗培養(yǎng)2～3 d 后，將純化1次后的菌落挑取至含銻的CDM培養(yǎng)基上，至少進(jìn)行3次劃線純化，直至獲得單一菌落。將純化的菌株接種于LB斜面培養(yǎng)基，放入 4 ℃ 冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2"菌株的鑒定與形態(tài)觀察

對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，將菌種涂布在LB平板上，28 ℃培養(yǎng)2～4 d，觀察其菌落形態(tài)。生理生化試驗(yàn)方法均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》^［25］進(jìn)行。利用細(xì)菌DNA提取試劑盒對篩選出的菌株進(jìn)行DNA提取，然后進(jìn)行細(xì)菌基因組PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組 DNA（20 ng/μL）1 μL、10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg²⁺）5 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）1 μL、dNTP（10 mmol/L）1 μL、27F引物（10 mmol/L）1.5 μL、1492R引物（10 mmol/L）1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。引物序列為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3，以基因組DNA為模板。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物用 AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。回收后送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。將測序獲得菌株的16S rDNA序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列對比，通過BLAST進(jìn)行同源分析。

菌株液體培養(yǎng)，培養(yǎng)至D600 nm值為0.5～0.8時(shí)，于4 ℃，8 000 r/min，離心5 min。離心后倒掉上清液，收集沉淀于管底的菌體，使用PBS磷酸鹽緩沖液洗1～2次，舍棄上清液，沿管壁緩慢加入 4 ℃ 預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液，固定12 h后進(jìn)行SEM拍攝。

1.2.3"菌株在不同銻濃度下生長曲線的測定

經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后，將菌株A-73-1接種在不同銻濃度（0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基，在28 ℃的搖床以120 r/min培養(yǎng)7 d，每天取液1次，制成菌懸液并測定D600 nm值。每個(gè)處理設(shè)重復(fù)3次，計(jì)算其平均值，并繪制生長曲線。

1.2.4"菌株的促生特性研究

采用Salkowski比色法^［26］測定菌株A-73-1分泌IAA的能力，固體LB培養(yǎng)基活化A-73-1菌株，然后接種于含 0.5 g/L 色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，120 r/min 28 ℃ 培養(yǎng)48 h，8 000 g 離心10 min，取2 mL上清液于5 mL離心管中，再加入等體積的Salkowski比色液（10.8 mol/L H2SO4含4.5 g/L FeCl3），室溫避光放置30 min。根據(jù)混合液的顏色可初步判斷產(chǎn)IAA量（若菌株產(chǎn)IAA，混合液則顯示紅色）﹔然后用分光光度計(jì)測定D530 nm，以空白培養(yǎng)基作對照，重復(fù)3次。以純IAA濃度（0、30、60、90、120、150 μg/mL）為橫坐標(biāo)，D530 nm值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的IAA濃度^［27］。參照Honma等的方法^［28-29］進(jìn)行ACC脫氨酶活性測定。將供試菌株接種在已滅菌的含不同銻濃度（0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L）的PKO液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、120 r/min的搖床培養(yǎng)7 d，每天記錄pH值的變化；同時(shí)取10 mL 溶液，4 000 r/min離心10 min，取其上清液用鉬銻抗比色法測定溶磷量^［30］。

1.2.5"油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)

將28 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h的菌液離心后，收集菌體，再用無菌水將菌液重新懸浮混勻至D600 nm ≈1，作為菌懸液備用。挑選顆粒飽滿的油菜種子，用75%乙醇溶液消毒10 min后，用無菌水洗凈，瀝干后放入菌懸液浸泡2 h后，迅速將種子取出，在無菌環(huán)境中晾干，備用。在培養(yǎng)皿中鋪2層滴入等量不同銻濃度（0、20、40、60 mg/L）溶液浸濕的濾紙，放置菌液處理過的30粒油菜種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于人工氣候培養(yǎng)箱，溫度25 ℃，濕度75%，光—暗周期為 14 h—10 h 靜置培養(yǎng)。以不加菌液處理的種子作為對照。培養(yǎng) 7 d 后，用游標(biāo)卡尺測量幼苗的根長、莖長，用天平稱其鮮重、干重等指標(biāo)。

1.2.6"油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)

為測定抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量，萌發(fā)7 d后，取油菜根、莖連接處的新鮮組織，置于冰水浴條件下研磨，取上清液置于冰中進(jìn)行酶活性測定。過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用可見光法測定，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用比色法測定，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用羥胺法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。檢測均采用試劑盒法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.7"油菜種子萌發(fā)后各部位銻含量測定

油菜種子萌發(fā)7 d后，收集根、莖、葉，測定其銻含量，按照GB/T 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)"食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定。

1.3"數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 8.0 軟件繪制相關(guān)圖形。

2"結(jié)果與分析

2.1"耐銻菌株的篩選及分子生物學(xué)鑒定

從錫礦山金蕎麥根際土壤中分離得到耐銻菌株，命名為A-73-1。在LB培養(yǎng)基上，菌落隆起，邊緣規(guī)則，表面光滑，呈黃色，如圖1-A所示。當(dāng) 16S rDNA 序列同源性高于 97% 時(shí)，可以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種^［31］。以16S rDNA基因通用引物27F/1492R對菌株A-73-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 1 500 bp 左右的特異性條帶（圖1-A）。將菌株 A-73-1 的16S rDNA序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，顯示菌株A-73-1與Cupriavidus metallidurans strain NBRC 102507 （NR_114128.1）、Cupriavidus metallidurans CH34 （NR_074704.1）的相似性高達(dá)98.86%，故判斷菌株A-73-1為貪銅菌（Cupriavidus metalliduran）。掃描電鏡結(jié)果如圖 1-C、圖1-D所示，菌體呈短桿狀，表面有褶皺。

2.2"菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株A-73-1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。菌株A-73-1是一株好氧革蘭氏陰性菌，經(jīng)淀粉水解、過氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)，結(jié)果均為陽性，甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3"不同濃度銻對菌株A-73-1生長影響

如圖2可知，菌株A-73-1在0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L的銻濃度下，菌株的D600 nm隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加迅速增長。對照（不加銻）、243.52 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm在培養(yǎng)3 d時(shí)達(dá)到最高值，分別為2.156 6、2.578 4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對照、243.52 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm在 4 d 時(shí)開始下降。608.80 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm則在4 d時(shí)達(dá)到最高值，為2.062 7，在5 d時(shí)開始平緩降低。在1 217.60 mg/L銻濃度下，菌株剛開始生長較緩慢，D600 nm在4 d時(shí)達(dá)到最高值1.832 4，到5 d時(shí)便出現(xiàn)降低的情況。試驗(yàn)初步表明，菌株A-73-1的最適生長濃度為243.52 mg/L銻濃度，最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d；即使在高達(dá)1 217.60 mg/L的銻濃度下，菌株A-73-1也能生長，進(jìn)一步表明菌株A-73-1具有修復(fù)被重金屬銻污染土壤的潛力。

2.4"菌株A-73-1產(chǎn)IAA的能力

植物根際促生菌能夠分泌植物激素IAA， 能夠有效刺激植物細(xì)胞伸長，促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化。菌株A-73-1產(chǎn)生的IAA如圖3-A所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.020 6x＋0.118 9（r²=0.999 2），計(jì)算菌株A-73-1產(chǎn)IAA的能力，菌株A-73-1產(chǎn)IAA的量達(dá)到（93.33±1.03） μg/mL，這說明該菌株能分泌大量的IAA。

2.5"銻脅迫下菌株A-73-1的溶磷能力及pH值的動(dòng)態(tài)變化

培養(yǎng)前，將不同銻濃度培養(yǎng)液的pH值統(tǒng)一調(diào)整至7左右。菌株在不同銻脅迫下產(chǎn)生的溶磷量及pH值的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示。結(jié)果表明，在不同銻濃度下，pH值和溶磷量呈負(fù)相關(guān)。從培養(yǎng)2 d開始，不同銻濃度培養(yǎng)液pH值急劇下降，溶磷量均顯著增加。不加銻、243.52 mg/L 銻濃度下的培養(yǎng)液在培養(yǎng)3 d，溶磷量達(dá)到最大值，分別為431.75、445.61 μg/mL，pH值則降至3.86、3.82。608.80、1 217.60 mg/L 銻濃度下的培養(yǎng)液則在培養(yǎng)4 d溶磷量達(dá)到最大值，分別為432.45、368.97 μg/mL，pH值則分別降至3.88、4.05。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株可能因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)缺乏或吸收過量銻而死亡，從而導(dǎo)致溶磷量逐漸下降。到6 d，不加銻、243.52、608.80、1 217.60 mg/L 銻濃度下的溶磷量分別下降至113.67、225.59、151.44、97.36 μg/mL，pH值分別為6.84、6.00、6.67、7.07。243.52 mg/L 銻濃度脅迫3 d，菌株A-73-1的溶磷能力達(dá)到最佳。以上結(jié)果表明，不同濃度銻脅迫下菌株A-73-1仍具有溶磷能力，說明菌株可用于銻污染農(nóng)田修復(fù)。

2.6"銻脅迫下菌株A-73-1產(chǎn)ACC脫氨酶的能力

如表2所示，在不同濃度銻處理下，菌株A-73-1產(chǎn)生的ACC脫氨酶活性表現(xiàn)為243.52 mg/L＞不加銻＞608.80 mg/L＞1 217.60 mg/L。在 243.52 mg/L 銻濃度下菌株A-73-1產(chǎn)生的ACC脫氨酶活性為（0.0478 6±0.012 3） U/mg，且在高達(dá) 1 217.60 mg/L 銻濃度下菌株也仍能產(chǎn)生ACC脫氨酶。

2.7"不同濃度銻脅迫下菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的影響

2.7.1"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的促生效果

在銻脅迫下，油菜種子萌發(fā)7 d后，接種菌株A-73-1組的油菜種子萌發(fā)情況要顯著優(yōu)于對照組。由表3可知，加入菌株A-73-1后油菜種子萌發(fā)的根長顯著增加；其中，在20 mg/L的銻濃度下，最長達(dá)到8.40 cm，較對照增長252.94%；在不加銻的情況下，較對照組增加45.09%。未接種 A-73-1的對照組在40、60 mg/L銻濃度下均未生根，只有根莖。接種A-73-1后，對萌發(fā)種子莖的增長同樣表現(xiàn)出類似顯著性，在不加銻、20、40、60 mg/L 銻濃度脅迫下，接種后較對照組分別增加了0.56、1.41、3.10、6.26倍。鮮重在不加銻的對照組和試驗(yàn)組之間沒有表現(xiàn)出顯著差異。其他銻脅迫下試驗(yàn)組的鮮重、干重均表現(xiàn)出比對照組顯著增長。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種菌株A-73-1后能明顯促進(jìn)萌發(fā)后油菜種子的生長。

2.7.2"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化物的影響

銻脅迫可以誘導(dǎo)ROS（活性氧自由基）的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出對油菜等植物的毒害作用。由CAT、POD、SOD等活性物質(zhì)組成的抗氧化酶系統(tǒng)可以消除ROS的生成，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受過氧化損傷帶來的毒害。油菜種子在不加銻、20、40、60 mg/L銻濃度脅迫下，添加菌株A-73-1后，測得萌發(fā)7 d后的CAT活性（圖 5-A）與相同處理下的對照比，均有顯著提高，分別提高110.11%、150.20%、186.48%、208.52%。測得POD活性（圖5-B），分別提高79.21%、120.52%、120.11%、140.14%。測得SOD活性（圖5-C），分別提高21.96%、73.55%、147.69%、230.68%。在銻脅迫下，植物產(chǎn)生抗氧化酶的能力隨著銻濃度的增加而逐漸降低，而接種促生菌株 A-73-1 后可以提高植物產(chǎn)生CAT、POD、SOD等抗氧化酶的能力，使得油菜根際細(xì)胞受到的氧化損傷得到有效抑制。

MDA的積累量能夠間接反映出細(xì)胞損傷的程度，如圖5-D可知，接種菌株A-73-1的處理組在20、40、60 mg/L銻濃度的脅迫下顯著降低了MDA的積累，分別降低37.02%、49.30%、57.17%。在60 mg/L的銻濃度下，對照組的MDA含量為9.27 nmol/mL，處理組的MDA含量僅為 3.97 nmol/mL。試驗(yàn)結(jié)果說明，接種菌株A-73-1后能提高油菜種子的抗逆性，增強(qiáng)銻脅迫下植物的自我調(diào)控能力。

2.7.3"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子吸收銻的影響

由圖6可知，萌發(fā)7 d后，接種菌株A-73-1能降低萌發(fā)后油菜種子銻的積累，銻脅迫下油菜根（根莖）、莖、葉中的銻含量均隨脅迫濃度的增加呈增加趨勢，且根（根莖）gt;莖gt;葉。特別是在 60 mg/L 銻脅迫處理下，根（根莖）、莖、葉的銻濃度分別比未接種菌株A-73-1的處理降低42.97%、48.36%、77.99%。試驗(yàn)結(jié)果表明，油菜種子接種菌株A-73-1后能顯著降低銻的積累。

3"結(jié)論與討論

微生物修復(fù)作為一種新興的土壤重金屬修復(fù)技術(shù)，已經(jīng)成為當(dāng)前修復(fù)重金屬污染土壤的研究熱點(diǎn)。受重金屬污染的土壤中，可能生存著某些能適應(yīng)該種污染環(huán)境且完成自身正常生理代謝的細(xì)菌種類，這些細(xì)菌能產(chǎn)生植物激素、鐵載體、有機(jī)酸、酶類等代謝產(chǎn)物，并促進(jìn)植物生長^［32］。本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥根際土樣中，分離出1株耐銻根際促生細(xì)菌A-73-1，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA基因測序等方法，鑒定該菌株為貪銅菌（Cupriavidus metalliduran）。

研究發(fā)現(xiàn)，該菌對多種重金屬都有較好的耐受性，能在1 217.60 mg/L銻濃度下生存。李?yuàn)櫡f等從Sb污染的土壤中篩選得到1株假單胞菌屬菌株ZLX16，能耐受0.24 mg/L的Sb（Ⅲ）及1.22 mg/L的Sb（Ⅴ）^［32］。杜輝輝等從湖南省冷水江錫礦山尾渣土壤中篩選分離出3株耐銻細(xì)菌［蒼白桿菌（Ochrobactrum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）］，最高耐銻濃度可達(dá)2 000 mg/L^［33］。菌株A-73-1在銻脅迫下的IAA產(chǎn)量為 93.33 μg/mL， 這一結(jié)果優(yōu)于聶孝紅等的發(fā)現(xiàn)，即非銻脅迫下4株均能分泌IAA的細(xì)菌，其中Stenotrophomonas屬菌株NXH-3的IAA最高產(chǎn)量為90.16 μg/mL^［34］。在243.52 mg/L銻脅迫下菌株A-73-1的ACC脫氨酶產(chǎn)量為0.047 86 U/mg，ACC脫氨酶能緩解逆境脅迫下所產(chǎn)生的乙烯對植物造成的傷害，從而提升植物的抗逆能力，促進(jìn)植物生長發(fā)育^［35-36］。同時(shí)，在243.52 mg/L 銻濃度下菌株A-73-1的可溶磷產(chǎn)量達(dá)到445.61 μg/mL，這一結(jié)果優(yōu)于呂俊等的發(fā)現(xiàn)，即菌株WJ27伯克霍爾德菌在第5天的最大溶磷量為411.98 μg/mL^［30］。初步推測，菌株A-73-1通過產(chǎn)有機(jī)酸促進(jìn)難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芰?，但其解磷機(jī)制還需進(jìn)一步研究。菌株A-73-1在銻脅迫下的優(yōu)良促生性具有進(jìn)一步開發(fā)為微生物菌劑的潛力。

不同濃度銻脅迫下的油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未接種的處理對比，接種A-73-1萌發(fā)后種子的根長、莖長、鮮重、干重、銻含量均有顯著性差異，說明菌株A-73-1能夠在一定程度上緩解重金屬銻對油菜種子萌發(fā)的影響，減輕銻對萌發(fā)后種子的生長毒性。其他研究也發(fā)現(xiàn)，PGPR能促進(jìn)重金屬脅迫下萌發(fā)后種子的生長，如姚強(qiáng)等將小麥種子浸泡在菌液中與不接菌的處理相比，芽長和根長平均提升20%～26%^［37］。重金屬脅迫能使植物產(chǎn)生大量ROS，破壞植物蛋白質(zhì)和DNA等，最終導(dǎo)致植物的氧化脅迫^［38］。SOD、CAT、POD通過清除過量ROS而減緩重金屬對植物的脅迫，是植物抵抗重金屬脅迫重要的抗氧化酶^［39］。研究結(jié)果顯示，在銻脅迫下接種菌株A-73-1，可通過提高SOD、CAT、POD的活性來抵抗這種脅迫產(chǎn)生的氧化損傷，從而幫助萌發(fā)后的種子提高對重金屬的抗性并生長。本研究中MDA含量的減少也證明了這一點(diǎn)，尤其在高濃度銻脅迫下（60 mg/L），接種菌株A-73-1的處理組顯著降低了萌發(fā)后種子MDA的積累，降低57.17%。MDA 是植物細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)下的產(chǎn)物，MDA的過量積累會引起蛋白質(zhì)、DNA 等大分子的交聯(lián)聚合，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和功能發(fā)生改變^［40］。史雅甜研究發(fā)現(xiàn)，羊蹄草的MDA含量隨著Cd、Pb濃度的升高而增加^［41］。另一方面，本研究也表明，與未加菌的處理對比，添加菌株A-73-1的油菜種子萌發(fā)后，其根、莖、葉的銻含量顯著下降（Plt;0.05）；尤其是葉部，60 mg/L銻脅迫處理下降了77.99%，說明菌株A-73-1能顯著降低銻在萌發(fā)后油菜種子體內(nèi)的向上轉(zhuǎn)運(yùn)。推測菌株A-73-1可能是通過產(chǎn)生植物激素（如 IAA）減少銻在萌發(fā)后種子中的積累與轉(zhuǎn)運(yùn)。也有研究表明，IAA能通過增加根尖數(shù)量和根表面積來減少重金屬在根部的積累^［42］。這也可能通過與細(xì)菌 IAA 誘導(dǎo)在根部產(chǎn)生螯合劑等分泌物形成螯合物，從而減少銻的吸收，需要作進(jìn)一步的研究。

PGPR對植物在非生物脅迫下具有一定的促生效果，并增強(qiáng)植物抗逆能力，但未見報(bào)道Cupriavidus metalliduran對銻脅迫下油菜種子的促生作用。本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥根際土樣得到PGPR Cupriavidus metalliduran A-73-1，能顯著促進(jìn)銻脅迫下萌發(fā)后油菜種子的生長，且能顯著降低銻在油菜種子體內(nèi)的積累與轉(zhuǎn)運(yùn)。但本研究僅對株菌 A-73-1 基本促生效應(yīng)進(jìn)行了初步探討，針對菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的內(nèi)在促生機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究?？傮w來說，本試驗(yàn)篩選的耐銻PGPR 菌株A-73-1，對銻脅迫下萌發(fā)后種子的生長發(fā)揮著重要的作用。期待本研究結(jié)果可為A-73-1進(jìn)一步開發(fā)成促生菌劑或微生物有機(jī)肥用于修復(fù)銻污染農(nóng)田提供依據(jù)，也為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的可持續(xù)農(nóng)業(yè)提供潛在的解決方案。

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