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        1株耐銻根際促生菌的篩選鑒定及對銻脅迫下油菜種子萌發(fā)的影響

        2025-03-27 00:00:00劉燦鄒娣董思陳嘉懿白婧鄭玉
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2025年1期
        關(guān)鍵詞:根際油菜重金屬

        摘要:從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥(Fagopyrum dibotrys)根際土壤中篩選出1株耐銻根際促生菌A-73-1,對該菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察,分析該菌株在銻脅迫下的潛在促生能力,同時(shí)通過種子萌發(fā)試驗(yàn),探究銻脅迫下該菌株對油菜種子萌發(fā)的影響。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列測序,鑒定該菌株為好氧革蘭氏陰性菌,屬貪銅菌 (Cupriavidus metalliduran)。 菌株IAA產(chǎn)量最高為93.33 μg/mL;在243.52 mg/L銻脅迫下,最大無機(jī)溶磷量為 445.61 μg/mL,ACC脫氨酶產(chǎn)量最高為0.047 86 U/mg。在不同濃度銻(20、40、60 mg/L)脅迫下觀察油菜種子的萌發(fā)結(jié)果,與對照組(不加銻)相比,接種 A-73-1后,幼苗的根長、莖長、鮮重、干重等生物量指標(biāo)均顯著提升,根系抗氧化酶活性顯著提升,丙二醛含量降低;種子萌發(fā)后根、莖、葉的銻含量顯著降低,尤其是在60 mg/L銻脅迫下,分別降低42.97%、48.36%、77.99%。菌株A-73-1有優(yōu)良的促生能力,并能提高銻脅迫下油菜幼苗的抗逆性,期待本研究結(jié)果可以為進(jìn)一步研發(fā)耐銻促生菌劑修復(fù)銻污染土壤提供理論依據(jù),同時(shí)為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的修復(fù)策略提供潛在解決方案。

        關(guān)鍵詞:銻脅迫;耐銻根際促生菌A-73-1;促生特性;油菜種子萌發(fā)

        中圖分類號:S634.304;S182;X53""文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號:1002-1302(2025)01-0262-09

        銻(antimony,Sb)是一種有毒的類金屬,世界衛(wèi)生組織規(guī)定,土壤中銻的最大允許含量為36 mg/kg,而我國許多地區(qū)土壤銻的含量遠(yuǎn)超規(guī)定含量[1-2]。莫昌琍等發(fā)現(xiàn),在貴州省獨(dú)山礦區(qū)周邊的農(nóng)用地上,銻含量達(dá)到220.80 mg/kg[3]。陳秋平等對貴州省晴隆銻礦區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn),礦區(qū)農(nóng)田土壤中的平均銻含量達(dá)到71.65 mg/kg[4]。湖南省錫礦山礦區(qū)周邊的土壤中,銻含量高達(dá)6 946 mg/kg,嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐闹参锷L和人們的身體健康[5-6]。湖南省農(nóng)田銻污染被認(rèn)為是亟待解決的重要生態(tài)環(huán)境問題。2022年3月,生態(tài)環(huán)境部印發(fā)的《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)重金屬污染防控的意見》中,首次將銻列為重點(diǎn)防控的類金屬污染物[7]。近年來,對土壤銻的相關(guān)研究工作也陸續(xù)展開,主要圍繞銻對動(dòng)植物的毒性以及在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化,但針對農(nóng)田銻污染的修復(fù)工作比較缺乏。目前,對土壤重金屬的修復(fù)方法主要有物理化學(xué)法[8-9]、生物修復(fù)法[10-11],但均存在處理成本高、修復(fù)方法較單一等問題,大多數(shù)無法實(shí)現(xiàn)農(nóng)田重金屬污染的“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”策略。

        甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)是我國種植面積最廣的油料作物,其中湖南省是種植面積最大的省份[12]。甘藍(lán)型油菜以“稻油”輪作為主,對鎘、銅、鋅等重金屬具有較強(qiáng)的富集能力,其籽粒中重金屬的富集量比根、莖、葉中低[13-15]。因此,甘藍(lán)型油菜較適宜于在重金屬污染的農(nóng)田種植且能保持其原有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,可認(rèn)為其具備綠色可持續(xù)修復(fù)所需的關(guān)鍵特質(zhì)。但目前有關(guān)油菜用于銻污染農(nóng)田修復(fù)的研究非常缺乏。

        根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacterica,PGPR) 是一類存活于土壤中或者定殖于植物根際、根表、根內(nèi)或植物莖葉內(nèi)的,可以促進(jìn)植物生長、增加作物產(chǎn)量或者拮抗植物病原微生物、防治作物病害的一系列細(xì)菌的統(tǒng)稱[16-18]。已有研究證明,在重金屬污染環(huán)境中,一些耐受重金屬的PGPR能通過抑制重金屬的活性而降低農(nóng)作物對重金屬的吸收量,同時(shí)保證糧食的安全生產(chǎn)。Pramanik等分離得到1株對重金屬鎘具有抗性的PGPR菌株K6,制成菌液后灌溉被鎘污染的水稻根際土壤,發(fā)現(xiàn)K6菌株對水稻幼苗具有一定的抗鎘能力,同時(shí)能促進(jìn)水稻根系的生長[19]。Liaquat等發(fā)現(xiàn),在28.10 mg/L的鎘濃度下,嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)處理后的辣椒種子根系長度是未處理辣椒種子的1.46倍,該菌具有較強(qiáng)的金屬耐受性和對鎘的生物修復(fù)潛力[20]。利用PGPR作為微生物修復(fù)劑,強(qiáng)化油菜生長從而修復(fù)銻污染農(nóng)田土壤,是一種非常有前景的綠色修復(fù)策略。

        本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥[Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara]的根際土壤中分離、篩選、鑒定得到1株耐銻能力較強(qiáng)的促生菌,研究其生理生化特性。植物種子的萌發(fā)影響植物的整個(gè)生長周期,萌發(fā)后的幼苗比植物更容易受到金屬毒性的影響。本研究分析銻脅迫下,油菜種子萌發(fā)后其幼苗的生長特性及根系的抗氧化酶活性等相關(guān)指標(biāo),以期為利用耐銻PGPR與油菜聯(lián)合修復(fù)銻污染農(nóng)田土壤提供可行方案和理論依據(jù),同時(shí)為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的修復(fù)策略提供潛在的解決方案。

        1"材料與方法

        1.1"供試材料

        試驗(yàn)于2020年7月在湖南省婁底市湖南人文科技學(xué)院進(jìn)行。

        供試土壤:于婁底市冷水江市(27°30′49″~27°50′38″N,111°18′57′~111°36′40″E)錫礦山地區(qū),采用5點(diǎn)取樣法,采集125份土樣,均裝入無菌采樣袋,標(biāo)注地理坐標(biāo),帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰柜中保存[21]。

        供試培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基[22]、CDM培養(yǎng)基[23]、無機(jī)磷(PKO)液體培養(yǎng)基[24]。

        供試油菜種子:甘藍(lán)型油菜婁文油98種子,由湖南省婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

        不同濃度銻(Sb Ⅲ)溶液由半水合酒石酸銻鉀(C4H4KO7Sb·1/2H2O)分析純配制。

        1.2"試驗(yàn)方法

        1.2.1"菌株篩選分離

        取根際土壤懸液,梯度稀釋至10-3涂布于LB平板,28 ℃ 培養(yǎng)2~4 d后,挑取不同菌落置于LB培養(yǎng)基上劃線純化,暗培養(yǎng)2~3 d 后,將純化1次后的菌落挑取至含銻的CDM培養(yǎng)基上,至少進(jìn)行3次劃線純化,直至獲得單一菌落。將純化的菌株接種于LB斜面培養(yǎng)基,放入 4 ℃ 冰箱中保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

        1.2.2"菌株的鑒定與形態(tài)觀察

        對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,將菌種涂布在LB平板上,28 ℃培養(yǎng)2~4 d,觀察其菌落形態(tài)。生理生化試驗(yàn)方法均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]進(jìn)行。利用細(xì)菌DNA提取試劑盒對篩選出的菌株進(jìn)行DNA提取,然后進(jìn)行細(xì)菌基因組PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組 DNA(20 ng/μL)1 μL、10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)5 μL、Taq聚合酶(5 U/μL)1 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、27F引物(10 mmol/L)1.5 μL、1492R引物(10 mmol/L)1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。引物序列為27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R:5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3,以基因組DNA為模板。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸 90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物用 AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。回收后送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。將測序獲得菌株的16S rDNA序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列對比,通過BLAST進(jìn)行同源分析。

        菌株液體培養(yǎng),培養(yǎng)至D600 nm值為0.5~0.8時(shí),于4 ℃,8 000 r/min,離心5 min。離心后倒掉上清液,收集沉淀于管底的菌體,使用PBS磷酸鹽緩沖液洗1~2次,舍棄上清液,沿管壁緩慢加入 4 ℃ 預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液,固定12 h后進(jìn)行SEM拍攝。

        1.2.3"菌株在不同銻濃度下生長曲線的測定

        經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后,將菌株A-73-1接種在不同銻濃度(0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基,在28 ℃的搖床以120 r/min培養(yǎng)7 d,每天取液1次,制成菌懸液并測定D600 nm值。每個(gè)處理設(shè)重復(fù)3次,計(jì)算其平均值,并繪制生長曲線。

        1.2.4"菌株的促生特性研究

        采用Salkowski比色法[26]測定菌株A-73-1分泌IAA的能力,固體LB培養(yǎng)基活化A-73-1菌株,然后接種于含 0.5 g/L 色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中,120 r/min 28 ℃ 培養(yǎng)48 h,8 000 g 離心10 min,取2 mL上清液于5 mL離心管中,再加入等體積的Salkowski比色液(10.8 mol/L H2SO4含4.5 g/L FeCl3),室溫避光放置30 min。根據(jù)混合液的顏色可初步判斷產(chǎn)IAA量(若菌株產(chǎn)IAA,混合液則顯示紅色)﹔然后用分光光度計(jì)測定D530 nm,以空白培養(yǎng)基作對照,重復(fù)3次。以純IAA濃度(0、30、60、90、120、150 μg/mL)為橫坐標(biāo),D530 nm值為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的IAA濃度[27]。參照Honma等的方法[28-29]進(jìn)行ACC脫氨酶活性測定。將供試菌株接種在已滅菌的含不同銻濃度(0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L)的PKO液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、120 r/min的搖床培養(yǎng)7 d,每天記錄pH值的變化;同時(shí)取10 mL 溶液,4 000 r/min離心10 min,取其上清液用鉬銻抗比色法測定溶磷量[30]。

        1.2.5"油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)

        將28 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h的菌液離心后,收集菌體,再用無菌水將菌液重新懸浮混勻至D600 nm ≈1,作為菌懸液備用。挑選顆粒飽滿的油菜種子,用75%乙醇溶液消毒10 min后,用無菌水洗凈,瀝干后放入菌懸液浸泡2 h后,迅速將種子取出,在無菌環(huán)境中晾干,備用。在培養(yǎng)皿中鋪2層滴入等量不同銻濃度(0、20、40、60 mg/L)溶液浸濕的濾紙,放置菌液處理過的30粒油菜種子,每個(gè)處理重復(fù)3次,置于人工氣候培養(yǎng)箱,溫度25 ℃,濕度75%,光—暗周期為 14 h—10 h 靜置培養(yǎng)。以不加菌液處理的種子作為對照。培養(yǎng) 7 d 后,用游標(biāo)卡尺測量幼苗的根長、莖長,用天平稱其鮮重、干重等指標(biāo)。

        1.2.6"油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)

        為測定抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量,萌發(fā)7 d后,取油菜根、莖連接處的新鮮組織,置于冰水浴條件下研磨,取上清液置于冰中進(jìn)行酶活性測定。過氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用可見光法測定,過氧化物酶(peroxidase,POD)活性采用比色法測定,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用羥胺法測定,MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定。檢測均采用試劑盒法,試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

        1.2.7"油菜種子萌發(fā)后各部位銻含量測定

        油菜種子萌發(fā)7 d后,收集根、莖、葉,測定其銻含量,按照GB/T 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)"食品中多元素的測定》,采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定。

        1.3"數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤,用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并用Origin 8.0 軟件繪制相關(guān)圖形。

        2"結(jié)果與分析

        2.1"耐銻菌株的篩選及分子生物學(xué)鑒定

        從錫礦山金蕎麥根際土壤中分離得到耐銻菌株,命名為A-73-1。在LB培養(yǎng)基上,菌落隆起,邊緣規(guī)則,表面光滑,呈黃色,如圖1-A所示。當(dāng) 16S rDNA 序列同源性高于 97% 時(shí),可以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種[31]。以16S rDNA基因通用引物27F/1492R對菌株A-73-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得 1 500 bp 左右的特異性條帶(圖1-A)。將菌株 A-73-1 的16S rDNA序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中比對,顯示菌株A-73-1與Cupriavidus metallidurans strain NBRC 102507 (NR_114128.1)、Cupriavidus metallidurans CH34 (NR_074704.1)的相似性高達(dá)98.86%,故判斷菌株A-73-1為貪銅菌(Cupriavidus metalliduran)。掃描電鏡結(jié)果如圖 1-C、圖1-D所示,菌體呈短桿狀,表面有褶皺。

        2.2"菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

        菌株A-73-1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。菌株A-73-1是一株好氧革蘭氏陰性菌,經(jīng)淀粉水解、過氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn),結(jié)果均為陽性,甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

        2.3"不同濃度銻對菌株A-73-1生長影響

        如圖2可知,菌株A-73-1在0、243.52、608.80、1 217.60 mg/L的銻濃度下,菌株的D600 nm隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加迅速增長。對照(不加銻)、243.52 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm在培養(yǎng)3 d時(shí)達(dá)到最高值,分別為2.156 6、2.578 4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,對照、243.52 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm在 4 d 時(shí)開始下降。608.80 mg/L銻濃度下的菌株D600 nm則在4 d時(shí)達(dá)到最高值,為2.062 7,在5 d時(shí)開始平緩降低。在1 217.60 mg/L銻濃度下,菌株剛開始生長較緩慢,D600 nm在4 d時(shí)達(dá)到最高值1.832 4,到5 d時(shí)便出現(xiàn)降低的情況。試驗(yàn)初步表明,菌株A-73-1的最適生長濃度為243.52 mg/L銻濃度,最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d;即使在高達(dá)1 217.60 mg/L的銻濃度下,菌株A-73-1也能生長,進(jìn)一步表明菌株A-73-1具有修復(fù)被重金屬銻污染土壤的潛力。

        2.4"菌株A-73-1產(chǎn)IAA的能力

        植物根際促生菌能夠分泌植物激素IAA, 能夠有效刺激植物細(xì)胞伸長,促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化。菌株A-73-1產(chǎn)生的IAA如圖3-A所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.020 6x+0.118 9(r2=0.999 2),計(jì)算菌株A-73-1產(chǎn)IAA的能力,菌株A-73-1產(chǎn)IAA的量達(dá)到(93.33±1.03) μg/mL,這說明該菌株能分泌大量的IAA。

        2.5"銻脅迫下菌株A-73-1的溶磷能力及pH值的動(dòng)態(tài)變化

        培養(yǎng)前,將不同銻濃度培養(yǎng)液的pH值統(tǒng)一調(diào)整至7左右。菌株在不同銻脅迫下產(chǎn)生的溶磷量及pH值的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示。結(jié)果表明,在不同銻濃度下,pH值和溶磷量呈負(fù)相關(guān)。從培養(yǎng)2 d開始,不同銻濃度培養(yǎng)液pH值急劇下降,溶磷量均顯著增加。不加銻、243.52 mg/L 銻濃度下的培養(yǎng)液在培養(yǎng)3 d,溶磷量達(dá)到最大值,分別為431.75、445.61 μg/mL,pH值則降至3.86、3.82。608.80、1 217.60 mg/L 銻濃度下的培養(yǎng)液則在培養(yǎng)4 d溶磷量達(dá)到最大值,分別為432.45、368.97 μg/mL,pH值則分別降至3.88、4.05。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,菌株可能因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)缺乏或吸收過量銻而死亡,從而導(dǎo)致溶磷量逐漸下降。到6 d,不加銻、243.52、608.80、1 217.60 mg/L 銻濃度下的溶磷量分別下降至113.67、225.59、151.44、97.36 μg/mL,pH值分別為6.84、6.00、6.67、7.07。243.52 mg/L 銻濃度脅迫3 d,菌株A-73-1的溶磷能力達(dá)到最佳。以上結(jié)果表明,不同濃度銻脅迫下菌株A-73-1仍具有溶磷能力,說明菌株可用于銻污染農(nóng)田修復(fù)。

        2.6"銻脅迫下菌株A-73-1產(chǎn)ACC脫氨酶的能力

        如表2所示,在不同濃度銻處理下,菌株A-73-1產(chǎn)生的ACC脫氨酶活性表現(xiàn)為243.52 mg/L>不加銻>608.80 mg/L>1 217.60 mg/L。在 243.52 mg/L 銻濃度下菌株A-73-1產(chǎn)生的ACC脫氨酶活性為(0.0478 6±0.012 3) U/mg,且在高達(dá) 1 217.60 mg/L 銻濃度下菌株也仍能產(chǎn)生ACC脫氨酶。

        2.7"不同濃度銻脅迫下菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的影響

        2.7.1"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的促生效果

        在銻脅迫下,油菜種子萌發(fā)7 d后,接種菌株A-73-1組的油菜種子萌發(fā)情況要顯著優(yōu)于對照組。由表3可知,加入菌株A-73-1后油菜種子萌發(fā)的根長顯著增加;其中,在20 mg/L的銻濃度下,最長達(dá)到8.40 cm,較對照增長252.94%;在不加銻的情況下,較對照組增加45.09%。未接種 A-73-1的對照組在40、60 mg/L銻濃度下均未生根,只有根莖。接種A-73-1后,對萌發(fā)種子莖的增長同樣表現(xiàn)出類似顯著性,在不加銻、20、40、60 mg/L 銻濃度脅迫下,接種后較對照組分別增加了0.56、1.41、3.10、6.26倍。鮮重在不加銻的對照組和試驗(yàn)組之間沒有表現(xiàn)出顯著差異。其他銻脅迫下試驗(yàn)組的鮮重、干重均表現(xiàn)出比對照組顯著增長。試驗(yàn)結(jié)果表明,接種菌株A-73-1后能明顯促進(jìn)萌發(fā)后油菜種子的生長。

        2.7.2"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化物的影響

        銻脅迫可以誘導(dǎo)ROS(活性氧自由基)的產(chǎn)生,從而表現(xiàn)出對油菜等植物的毒害作用。由CAT、POD、SOD等活性物質(zhì)組成的抗氧化酶系統(tǒng)可以消除ROS的生成,從而保護(hù)植物細(xì)胞免受過氧化損傷帶來的毒害。油菜種子在不加銻、20、40、60 mg/L銻濃度脅迫下,添加菌株A-73-1后,測得萌發(fā)7 d后的CAT活性(圖 5-A)與相同處理下的對照比,均有顯著提高,分別提高110.11%、150.20%、186.48%、208.52%。測得POD活性(圖5-B),分別提高79.21%、120.52%、120.11%、140.14%。測得SOD活性(圖5-C),分別提高21.96%、73.55%、147.69%、230.68%。在銻脅迫下,植物產(chǎn)生抗氧化酶的能力隨著銻濃度的增加而逐漸降低,而接種促生菌株 A-73-1 后可以提高植物產(chǎn)生CAT、POD、SOD等抗氧化酶的能力,使得油菜根際細(xì)胞受到的氧化損傷得到有效抑制。

        MDA的積累量能夠間接反映出細(xì)胞損傷的程度,如圖5-D可知,接種菌株A-73-1的處理組在20、40、60 mg/L銻濃度的脅迫下顯著降低了MDA的積累,分別降低37.02%、49.30%、57.17%。在60 mg/L的銻濃度下,對照組的MDA含量為9.27 nmol/mL,處理組的MDA含量僅為 3.97 nmol/mL。試驗(yàn)結(jié)果說明,接種菌株A-73-1后能提高油菜種子的抗逆性,增強(qiáng)銻脅迫下植物的自我調(diào)控能力。

        2.7.3"菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子吸收銻的影響

        由圖6可知,萌發(fā)7 d后,接種菌株A-73-1能降低萌發(fā)后油菜種子銻的積累,銻脅迫下油菜根(根莖)、莖、葉中的銻含量均隨脅迫濃度的增加呈增加趨勢,且根(根莖)gt;莖gt;葉。特別是在 60 mg/L 銻脅迫處理下,根(根莖)、莖、葉的銻濃度分別比未接種菌株A-73-1的處理降低42.97%、48.36%、77.99%。試驗(yàn)結(jié)果表明,油菜種子接種菌株A-73-1后能顯著降低銻的積累。

        3"結(jié)論與討論

        微生物修復(fù)作為一種新興的土壤重金屬修復(fù)技術(shù),已經(jīng)成為當(dāng)前修復(fù)重金屬污染土壤的研究熱點(diǎn)。受重金屬污染的土壤中,可能生存著某些能適應(yīng)該種污染環(huán)境且完成自身正常生理代謝的細(xì)菌種類,這些細(xì)菌能產(chǎn)生植物激素、鐵載體、有機(jī)酸、酶類等代謝產(chǎn)物,并促進(jìn)植物生長[32]。本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥根際土樣中,分離出1株耐銻根際促生細(xì)菌A-73-1,根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA基因測序等方法,鑒定該菌株為貪銅菌(Cupriavidus metalliduran)。

        研究發(fā)現(xiàn),該菌對多種重金屬都有較好的耐受性,能在1 217.60 mg/L銻濃度下生存。李?yuàn)櫡f等從Sb污染的土壤中篩選得到1株假單胞菌屬菌株ZLX16,能耐受0.24 mg/L的Sb(Ⅲ)及1.22 mg/L的Sb(Ⅴ)[32]。杜輝輝等從湖南省冷水江錫礦山尾渣土壤中篩選分離出3株耐銻細(xì)菌[蒼白桿菌(Ochrobactrum)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)],最高耐銻濃度可達(dá)2 000 mg/L[33]。菌株A-73-1在銻脅迫下的IAA產(chǎn)量為 93.33 μg/mL, 這一結(jié)果優(yōu)于聶孝紅等的發(fā)現(xiàn),即非銻脅迫下4株均能分泌IAA的細(xì)菌,其中Stenotrophomonas屬菌株NXH-3的IAA最高產(chǎn)量為90.16 μg/mL[34]。在243.52 mg/L銻脅迫下菌株A-73-1的ACC脫氨酶產(chǎn)量為0.047 86 U/mg,ACC脫氨酶能緩解逆境脅迫下所產(chǎn)生的乙烯對植物造成的傷害,從而提升植物的抗逆能力,促進(jìn)植物生長發(fā)育[35-36]。同時(shí),在243.52 mg/L 銻濃度下菌株A-73-1的可溶磷產(chǎn)量達(dá)到445.61 μg/mL,這一結(jié)果優(yōu)于呂俊等的發(fā)現(xiàn),即菌株WJ27伯克霍爾德菌在第5天的最大溶磷量為411.98 μg/mL[30]。初步推測,菌株A-73-1通過產(chǎn)有機(jī)酸促進(jìn)難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芰?,但其解磷機(jī)制還需進(jìn)一步研究。菌株A-73-1在銻脅迫下的優(yōu)良促生性具有進(jìn)一步開發(fā)為微生物菌劑的潛力。

        不同濃度銻脅迫下的油菜種子萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與未接種的處理對比,接種A-73-1萌發(fā)后種子的根長、莖長、鮮重、干重、銻含量均有顯著性差異,說明菌株A-73-1能夠在一定程度上緩解重金屬銻對油菜種子萌發(fā)的影響,減輕銻對萌發(fā)后種子的生長毒性。其他研究也發(fā)現(xiàn),PGPR能促進(jìn)重金屬脅迫下萌發(fā)后種子的生長,如姚強(qiáng)等將小麥種子浸泡在菌液中與不接菌的處理相比,芽長和根長平均提升20%~26%[37]。重金屬脅迫能使植物產(chǎn)生大量ROS,破壞植物蛋白質(zhì)和DNA等,最終導(dǎo)致植物的氧化脅迫[38]。SOD、CAT、POD通過清除過量ROS而減緩重金屬對植物的脅迫,是植物抵抗重金屬脅迫重要的抗氧化酶[39]。研究結(jié)果顯示,在銻脅迫下接種菌株A-73-1,可通過提高SOD、CAT、POD的活性來抵抗這種脅迫產(chǎn)生的氧化損傷,從而幫助萌發(fā)后的種子提高對重金屬的抗性并生長。本研究中MDA含量的減少也證明了這一點(diǎn),尤其在高濃度銻脅迫下(60 mg/L),接種菌株A-73-1的處理組顯著降低了萌發(fā)后種子MDA的積累,降低57.17%。MDA 是植物細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)下的產(chǎn)物,MDA的過量積累會引起蛋白質(zhì)、DNA 等大分子的交聯(lián)聚合,導(dǎo)致植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和功能發(fā)生改變[40]。史雅甜研究發(fā)現(xiàn),羊蹄草的MDA含量隨著Cd、Pb濃度的升高而增加[41]。另一方面,本研究也表明,與未加菌的處理對比,添加菌株A-73-1的油菜種子萌發(fā)后,其根、莖、葉的銻含量顯著下降(Plt;0.05);尤其是葉部,60 mg/L銻脅迫處理下降了77.99%,說明菌株A-73-1能顯著降低銻在萌發(fā)后油菜種子體內(nèi)的向上轉(zhuǎn)運(yùn)。推測菌株A-73-1可能是通過產(chǎn)生植物激素(如 IAA)減少銻在萌發(fā)后種子中的積累與轉(zhuǎn)運(yùn)。也有研究表明,IAA能通過增加根尖數(shù)量和根表面積來減少重金屬在根部的積累[42]。這也可能通過與細(xì)菌 IAA 誘導(dǎo)在根部產(chǎn)生螯合劑等分泌物形成螯合物,從而減少銻的吸收,需要作進(jìn)一步的研究。

        PGPR對植物在非生物脅迫下具有一定的促生效果,并增強(qiáng)植物抗逆能力,但未見報(bào)道Cupriavidus metalliduran對銻脅迫下油菜種子的促生作用。本研究從錫礦山優(yōu)勢植物金蕎麥根際土樣得到PGPR Cupriavidus metalliduran A-73-1,能顯著促進(jìn)銻脅迫下萌發(fā)后油菜種子的生長,且能顯著降低銻在油菜種子體內(nèi)的積累與轉(zhuǎn)運(yùn)。但本研究僅對株菌 A-73-1 基本促生效應(yīng)進(jìn)行了初步探討,針對菌株A-73-1對萌發(fā)后油菜種子的內(nèi)在促生機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究??傮w來說,本試驗(yàn)篩選的耐銻PGPR 菌株A-73-1,對銻脅迫下萌發(fā)后種子的生長發(fā)揮著重要的作用。期待本研究結(jié)果可為A-73-1進(jìn)一步開發(fā)成促生菌劑或微生物有機(jī)肥用于修復(fù)銻污染農(nóng)田提供依據(jù),也為“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的可持續(xù)農(nóng)業(yè)提供潛在的解決方案。

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