摘要：為探究外源色氨酸（Trp）對低氮水平下大豆幼苗的影響，以低氮敏感型大豆品種黑農(nóng)62為試驗材料，采用水培培養(yǎng)，在低氮水平下，于V1期進行Trp葉面噴施處理，Trp設(shè)置6個濃度：0、100、200、300、400、500 mg/L，處理6 d后，進行大豆光合特性、氮同化和抗氧化系統(tǒng)的測定分析，針對不同濃度Trp對低氮水平下大豆生長及生理的影響開展研究，并篩選出提高大豆低氮耐受性的Trp最適濃度。結(jié)果表明，外源200～300 mg/L Trp處理通過提高低氮水平下大豆NR、GS、GOGAT和GDH活性，增強植株對無機氮的吸收和同化，從而促進可溶性蛋白和氨基酸的合成，增加植株體內(nèi)氮素含量；同時，外源Trp處理顯著增加了低氮下大豆的Pn、Gs、Tr、Ci和葉綠素含量，增強了大豆光合效率，促進了光合產(chǎn)物的合成，提高了大豆干物質(zhì)積累量。此外，外源Trp還誘導(dǎo)了葉肉細胞內(nèi)抗氧化酶活性的進一步升高，降低脂質(zhì)過氧化程度，增強植株清除活性氧能力，緩解低氮對大豆生長帶來的不利影響，其中200 mg/L濃度Trp處理的緩解能力最強。綜上所述，外源 200～300 mg/L Trp處理通過調(diào)節(jié)低氮水平下大豆的氮同化能力、光合特性和抗氧化系統(tǒng)來提高大豆幼苗耐低氮能力，并且在200 mg/L濃度Trp處理下效果最好。

關(guān)鍵詞：大豆；低氮；色氨酸；生長；氮代謝；生理調(diào)控

中圖分類號：S565.101""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0094-09

氮素是大豆必需的大量營養(yǎng)素，不僅是氨基酸、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)、色素和其他關(guān)鍵有機分子的組成部分，還是大豆生長和產(chǎn)量的重要限制因素^［1-2］。由于大豆種子蛋白質(zhì)含量高，因此，它的氮需求相對于許多其他大田作物更高^［3］。雖然大豆是共生固氮作物，但其固定的氮素只占大豆全生育期需氮量的65%～70%，仍不足以維持其正常的生長發(fā)育^［4-6］。尤其在大豆苗期，生長對氮素尤為敏感，由于苗期根瘤在發(fā)育之中，尚無固氮能力，此時低氮往往會造成氮素“饑餓”，抑制大豆光合作用速率，影響光合產(chǎn)物積累以及無機碳、氮代謝產(chǎn)物水平，進而影響大豆正常發(fā)育進程^［7-11］。因此，低氮是限制苗期大豆生長的重要因素。

在我國大豆生產(chǎn)中，為了增加產(chǎn)量，過量及不合理施用氮肥的現(xiàn)象普遍存在。從2000年以來，我國氮肥的使用率呈逐年增加趨勢，消耗量已經(jīng)達到 3 000萬t/年，占據(jù)世界氮肥消費量的30%左右^［12］。但過量氮肥的施用會導(dǎo)致土壤板結(jié)，影響土壤理化性質(zhì)，使土壤質(zhì)量惡化，導(dǎo)致土壤環(huán)境惡性循環(huán)^［13］。國家出臺一系列減肥政策有效控制了過量氮肥施用對土壤造成的不利影響。在保障土壤有效利用的基礎(chǔ)上，為實現(xiàn)減氮不減產(chǎn)，筆者所在課題組針對外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對大豆氮素利用率及低氮耐受性的調(diào)控作用開展了相關(guān)研究，且已發(fā)現(xiàn)外源褪黑素能在低氮水平下通過提高氮代謝關(guān)鍵酶和銨同化相關(guān)酶的活性及其編碼基因的表達，有效提高大豆對低氮的耐受性^［14］。但鑒于褪黑素的穩(wěn)定性問題，其應(yīng)用受到一定的限制。

色氨酸（Trp）不僅是褪黑素的合成前體，也是蛋白質(zhì)合成所必需的氨基酸，被廣泛應(yīng)用于植物抵御各種非生物逆境的研究，并且近幾年相關(guān)研究證實色氨酸可以通過調(diào)節(jié)植物生長、分化和提高養(yǎng)分獲取能力來增強各種生化過程^［15-22］"。在低氮下，外源色氨酸通過增加高粱內(nèi)源生長素含量，激活質(zhì)膜H⁺-ATPase活性，促進質(zhì)膜酸化，提高根系能量代謝相關(guān)酶活性及 ATP 含量，促進根系發(fā)育^［18］；與此同時，通過調(diào)控低氮脅迫下衰老相關(guān)基因SbLHCB和SbSGR-2的表達，增強光合特性，調(diào)節(jié)葉片碳氮代謝，進而增強高粱對低氮的耐受性^［23］。另外，色氨酸還可通過轉(zhuǎn)氨基作用、脫氨基作用及其他同化過程，被植物吸收利用^［24-26］。相關(guān)研究證實色氨酸通過提高菜豆、小麥和玉米對氮肥的利用率，促進營養(yǎng)體生長，增加產(chǎn)量^［25-27］。此外，許多研究揭示了色氨酸次生代謝產(chǎn)物褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺）和吲哚-3-乙酸（IAA）具有促進根系發(fā)育、調(diào)控植株生長及產(chǎn)量構(gòu)成的能力^［28-34］。

然而，目前關(guān)于色氨酸對低氮水平下大豆幼苗生長及生理代謝指標影響的相關(guān)研究鮮有報道。因此，本試驗通過研究低氮水平下色氨酸對苗期大豆幼苗生長、物質(zhì)積累、光合特性、氮同化和抗氧化系統(tǒng)等相關(guān)指標的影響，探討外源色氨酸對大豆低氮耐受性的調(diào)控作用，以期為緩解大豆苗期低氮的不利影響提供新的思路及理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

本試驗選用的大豆品種為黑農(nóng)62（佳木斯先鋒種業(yè)公司選育），色氨酸購自Solarbio公司。

1.2"試驗設(shè)計

試驗于2022年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心實驗室進行，挑選大小一致、無蟲害、色澤均一的大豆種子進行苗期試驗。將選定的種子用蒸餾水洗滌，1%次氯酸鈉滅菌。置于育苗盆（長 80 cm，寬40 cm）中，采用蛭石基質(zhì)培養(yǎng)。3 d后選取生長健壯、長勢一致的幼苗（每個處理30株），轉(zhuǎn)入黑色水培盒（長17 cm，寬11 cm，高6.5 cm）在室溫下培養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h，7 d后去掉子葉，分別進行7.5 mmol/L（1/2 Hoagland營養(yǎng)液中對應(yīng)氮濃度）的對照氮濃度（normal nitrogen，NN）和 0.75 mmol/L 低氮濃度（low nitrogen，LN）處理。

試驗以低氮處理后的大豆幼苗為試驗材料，于V1期進行色氨酸處理，色氨酸處理設(shè)置0、100、200、300、400、500 mg/L "6個濃度（后文標記為T0、T100、T200、T300、T400、T500），分別進行葉面噴施，噴至葉面有液滴滴落為止。處理6 d后進行形態(tài)及生理指標的測定分析，形態(tài)和光合參數(shù)測定設(shè)置5次重復(fù)，生理指標測定設(shè)置3次重復(fù)。

1.3"測定內(nèi)容與方法

1.3.1"形態(tài)指標及生物量的測定

色氨酸處理6 d后，選取5株代表性植株，測定大豆植株株高、莖粗和葉面積；將植株莖、葉、柄、根分別取樣，105 ℃殺青30 min后，于80 ℃烘干至恒重，用千分之一天平稱重獲得各器官干物質(zhì)積累量。

1.3.2"光合指標的測定

按程亞嬌等所用方法^［35］測定葉綠素含量；采用硫酸蒽酮比色法^［36］測定可溶性糖含量；利用便攜式光合作用測定儀LI-6400XT（LI-COR，美國）測定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等光合參數(shù)。

1.3.3"氮代謝生理指標的測定

采用王學(xué)奎所用方法^［37］測定谷氨酰胺合成酶（GS）和硝酸還原酶（NR）的活性；參考Loulakakis等所用方法^［38］測定谷氨酸脫氫酶（GDH）活性；按照Singh等所用方法^［39］測定谷氨酸合成酶（GOGAT）活性；參照李合生所用方法^［36］測定硝態(tài)氮和游離氨基酸含量；按照湯章城所用方法^［40］測定銨態(tài)氮含量；采用徐志偉等所用方法^［41］測定酰脲含量；用考馬斯亮藍 G-250 染色法^［36］測定可溶性蛋白含量。

1.3.4"逆境生理指標的測定

按照李合生所用方法^［36］測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.4"數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel和SPSS 21.0等軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 9繪制圖表。

2"結(jié)果與分析

2.1"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期生長的影響

由圖1、表1可知，與CK相比，低氮水平顯著降低了大豆株高、莖粗、葉面積和地上部干物質(zhì)積累量。與單獨低氮處理（T0）相比，外源Trp處理增加了植株的株高，在100、200、300、400、500 mg/L濃度下分別增加13.77%、36.22%、15.97%、18.16%和7.88%，其中200 mg/L濃度色氨酸處理效果最顯著；100、200、300 mg/L的Trp處理植株的莖粗與單獨低氮處理間呈顯著差異，分別增加19.54%、20.20%、10.10%，而500、400 mg/L處理差異不顯著；與單獨低氮處理相比，葉面積和地上部干重隨著色氨酸濃度的增加，均呈先上升后下降的趨勢，并且在200 mg/L處理下效果最顯著；與單獨低氮處理相比，200 mg/L處理地下干重顯著增加26.09%。以上數(shù)據(jù)分析表明，噴施外源Trp可以增加低氮水平下大豆的株高、莖粗和葉面積，誘導(dǎo)低氮水平下大豆幼苗生長，促進地上和地下部干物質(zhì)積累，且200 mg/L處理的促進效果最為顯著。

2.2"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期光合特性的影響

如圖2-A至圖2-D所示，與CK相比，低氮水平顯著降低了大豆葉片中Pn、Gs、Ci和Tr，外源Trp處理后，各處理間Pn、GS、Ci和Tr均高于單獨低氮處理，且達到顯著水平。隨著Trp濃度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，外源Trp濃度為200 mg/L時，大豆葉片Pn 、Gs、Ci和Tr達到最大值，與單獨低氮處理相比分別增加54.08%、178.92%、8.01%和101.95%。與CK相比，大豆葉綠素含量在低氮水平下降低了122.22%，且達到顯著差異水平。與單獨低氮處理相比，僅200 mg/L Trp處理葉綠素含量顯著增加32.19%（圖2-E）。與CK相比，低氮處理顯著降低了大豆葉片中的可溶性糖含量，噴施外源Trp后各處理葉片可溶性糖含量均高于單獨低氮處理，且達到顯著水平，在200 mg/L處理下可溶性糖含量達到最大值（圖2-F）。以上數(shù)據(jù)分析表明，噴施外源Trp可以改善低氮水平下大豆的光合參數(shù)，提高對光合系統(tǒng)的保護作用，增加植株可溶性糖含量，且在200 mg/L處理下效果最好。

2.3"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶和谷氨酸脫氫酶在植物氮代謝途徑中起著關(guān)鍵作用。由圖3可知，與CK相比，低氮顯著降低了大豆葉片NR、GDH、GS和GOGAT活性。與單獨低氮處理相比，外源Trp處理后，各處理NR、GDH、GS和GOGAT活性均顯著增加，且隨著Trp濃度增加呈先上升后下降趨勢。其中，與單獨低氮處理相比，各處理間NR活性分別增加84.41%、107.27%、81.29%、78.75%和77.39%；GDH活性也同步增加146.91%、227.08%、246.16%、142.02%和130.33%；GS活性相應(yīng)增加42.38%、64.64%、42.85%、41.72%和31.99%；GOGAT活性分別增加199.29%、354.73%、208.48%、91.68%和94.98%。其中NR、GS和GOGAT活性均在200 mg/L Trp處理下促進效果最顯著，300 mg/L Trp處理對GDH活性的促進效果最好。以上數(shù)據(jù)分析表明，噴施外源Trp可在低氮水平下有效提高大豆體內(nèi)NR、GDH、GS和GOGAT活性，提高氮代謝關(guān)鍵酶活性，促進大豆氮同化能力提升，且在200～300 mg/L處理下促進效果最佳。

2.4"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期不同形態(tài)氮素含量的影響

植物體內(nèi)氮含量可作為直接反映氮代謝是否活躍的重要指標，是衡量大豆體內(nèi)氮素營養(yǎng)、氮素同化利用與再利用狀況的重要指標。如圖4所示，與CK相比，低氮條件下銨態(tài)氮、全氮和酰脲含量均顯著降低。其中，外源Trp處理后，T100～T400處理硝態(tài)氮含量均顯著低于單獨低氮處理，并且隨Trp濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，在200 mg/L處理下達到最低值（圖4-A）。銨態(tài)氮含量與硝態(tài)氮含量呈相似規(guī)律，與單獨低氮處理相比，200、 300 mg/L 處理達到顯著差異，分別降低了18.67%和16.22%，而100、400、500 mg/L處理沒有顯著差異（圖4-B）。外源Trp處理與單獨低氮處理相比，各處理大豆葉片全氮含量顯著增加，分別提高147.37%、721.05%、210.53%、176.32%和139.47%（圖4-C）。在圖4-D中，在低氮水平下隨著Trp濃度的增加，酰脲含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在200、300 mg/L處理下顯著高于單獨低氮處理，分別增加了41.11%和37.76%。以上數(shù)據(jù)分析表明，噴施外源Trp能提高低氮水平下大豆對硝態(tài)氮的吸收和銨態(tài)氮的同化，增加植株葉片全氮和酰脲含量，且在200～300 mg/L處理下效果最佳。

2.5"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期可溶性蛋白和氨基酸含量的影響

當?shù)毓?yīng)不足時，可溶性蛋白和氨基酸含量受到嚴重影響，顯著低于CK（圖5）。在低氮水平下，Trp處理后整體顯著增加了可溶性蛋白含量，且隨著Trp濃度增加呈先升后降的趨勢，200 mg/L Trp處理的可溶性蛋白含量達到最高值，與單獨低氮處理相比，200 mg/L Trp處理使可溶性蛋白含量提高了1.93倍，比對照高8.10%。與單獨低氮處理相比，Trp處理后顯著增加了游離氨基酸含量，但各處理間并無顯著差異。以上數(shù)據(jù)分析表明，外源Trp噴施處理能促進低氮水平下大豆可溶性蛋白合成，增加游離氨基酸的積累，200 mg/L 處理能更好地促進可溶性蛋白合成，但各處理間游離氨基酸含量的積累并無顯著影響。

2.6"外源色氨酸對低氮水平下大豆苗期葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由圖6可知，與CK相比，低氮水平顯著增加了大豆葉片POD和CAT活性。與單獨低氮處理相比，外源Trp處理后，各處理間SOD、POD和CAT活性均提高，并且隨著Trp濃度的增加呈先上升后下降趨勢。由圖6-A所示，與單獨低氮處理相比，外源Trp處理后，各處理間SOD活性分別提高26.59%、54.70%、33.04%、4.83%和4.66%，在200 mg/L Trp處理下SOD活性達到峰值。在圖6-B中，隨著Trp濃度的增加，大豆葉片POD活性呈先上升后下降趨勢，在200 mg/L處理下活性達到最大， 與單獨低氮處理相比， 活性顯著提高40.09%。

與SOD、POD活性趨勢一致，隨著Trp濃度的增加，CAT活性呈先上升后下降趨勢，且在 200 mg/L 處理下活性達到最大（圖6-C）。如圖 6-D 所示，與CK相比，低氮水平顯著增加了大豆葉片MDA含量，外源Trp處理后顯著降低了大豆葉片MDA含量，且隨著Trp濃度增加呈先下降后上升趨勢；與單獨低氮處理相比，各處理間分別顯著降低了46.80%、122.38%、44.90%、25.26%和22.07%。以上數(shù)據(jù)分析表明，噴施外源Trp能提高大豆抗氧化酶活性，緩解膜質(zhì)過氧化，在200 mg/L處理下緩解效果最佳。

3"討論

Trp廣泛存在于植物體內(nèi)，在植物苗期其含量水平達到峰值，隨著生育時期的延長，植株體內(nèi)內(nèi)源Trp含量逐漸減少，其含量水平與植物生長發(fā)育密切相關(guān)^［42］。對于不同的植物，其適宜色氨酸濃度也存在差異。因此，本研究從形態(tài)和生理角度篩選出在低氮下能促進大豆生長發(fā)育的最適Trp濃度，并闡明其生理調(diào)控機制。已有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度色氨酸噴施處理可有效促進油菜葉片與根系的發(fā)育，隨著濃度增加，促進效果逐漸減弱^［43］；500 mg/L色氨酸處理減輕了鹽脅迫下長春花幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)受損程度，提高了根系線粒體細胞色素c氧化酶活性，增強了植株鹽脅迫耐受性；但當色氨酸濃度增大到750 mg/L時，造成葉綠體變形，片層扭曲、變形，葉綠體模糊、瀕臨解體等負面影響^［44］。白羽扇豆（Lupinus albus L.）水分脅迫下葉面噴施0～300 μmol/L Trp的研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L Trp處理效果最好， 主要通過增強光合色素、吲哚乙酸、酚類和抗氧化能力等提高白羽扇豆植物的水分脅迫耐受性^［21］。在本試驗中，針對大豆低氮的研究發(fā)現(xiàn)，外源Trp可以通過提高幼苗氮代謝水平，改善植株光合，促進干物質(zhì)的積累，緩解因低氮對大豆造成的不利影響，濃度過高或者過低都會減弱緩解效果，且200～300 mg/L Trp緩解效果最好。

氮代謝是植物蛋白質(zhì)和氨基酸的主要來源，當植物處于低氮環(huán)境時，氮代謝的正常運行會受到影響^［45-47］。谷聞東等研究證實，外源Trp處理通過提高NR和GS活性，增加了無機氮源的同化和氮代謝底物的合成，可有效緩解高粱低氮脅迫^［23］。因此，本研究針對低氮水平下Trp對大豆氮代謝的調(diào)控作用進行探究。與單獨低氮處理相比，外源Trp處理顯著提升了NR活性，緩解了低氮對NO^-3還原限速酶的抑制作用^［48］。結(jié)合硝酸鹽含量的變化發(fā)現(xiàn)，外源Trp處理加速了低氮水平下大豆對NO^-3的吸收還原，說明Trp處理能通過增強NR活性，提高大豆對NO^-3的吸收。GS和GOGAT活性是將無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮的關(guān)鍵酶，在植物氮素同化中起著至關(guān)重要的作用^［49］。低氮水平下，銨氮含量顯著降低，可能與GS/GOGAT活性降低有關(guān)，GS/GOGAT途徑的抑制阻礙了無機氮同化為可溶性蛋白^［50］。外源色氨酸處理后，為銨的同化提供GS/GOGAT循環(huán)，誘導(dǎo)了可溶性蛋白合成和氨基酸的積累。

低氮會誘導(dǎo)植物衰老，引起氮組分降解，特別是光合酶和類囊體N，從而降低植株葉綠素含量，進而抑制光合作用^［51］。已有研究表明，谷氨酰胺合成酶能將銨同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺是葉綠素合成的重要氮供體^［52］。低氮抑制GS活性，進而導(dǎo)致氮代謝紊亂，銨大量積累，葉綠體解體，光合作用不能正常進行^［53］。外源Trp處理顯著增加了低氮水平下葉綠素含量，可能是通過增強對NH⁺4的同化，增加葉片中氮素含量，從而促進葉綠素的合成。本研究還發(fā)現(xiàn)外源Trp處理減弱了低氮對Pn、Gs、Tr和Ci的影響，這與鐘曉紅的研究結(jié)果^［54］類似。這說明外源Trp處理能夠通過提高低氮水平下大豆氣體的交換參數(shù)，促進大豆幼苗光合作用。這可能由于Trp施用改變了葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，使葉肉細胞內(nèi)葉綠素數(shù)量和每個葉肉基粒數(shù)增多，提高了葉綠素的含量，有效地增強了光合效率^{［44，54］}。

低氮抑制了大豆幼苗生理代謝，降低了生物量的積累，外源Trp處理有利于維持碳氮代謝平衡，提高植株光合作用，促進植株生長^［23］。已有研究證實，苗期Trp處理能有效促進油菜生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加，促進干物質(zhì)積累^［43］。在本試驗中，低氮抑制了幼苗干物質(zhì)積累，而外源Trp處理顯著增加了低氮水平下的大豆幼苗干物質(zhì)。因此，Trp一方面可以通過提高NR活性，加速對硝酸鹽的吸收，為GS/GOGAT循環(huán)提供更多底物，促進可溶性蛋白和氨基酸的積累；另一方面還可以增強植株光合作用，促進干物質(zhì)的積累，最終緩解低氮對大豆幼苗生長的抑制作用。

4"結(jié)論

低氮嚴重影響了苗期大豆的生長，外源200～300 mg/L的Trp處理能增強大豆NR、GS 、GOGAT和GDH活性，加速無機氮源的吸收與同化，提高低氮水平下大豆葉片中含氮化合物的含量，進而增強植株光合作用，促進碳水化合物的合成和積累，為植株生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，緩解低氮對大豆株高、莖粗和葉面積的不利影響，增加地上和地下部生物量積累。此外，外施色氨酸可增強低氮水平下大豆的抗氧化能力，減少因缺氮造成大豆葉片體內(nèi)ROS積累，降低MDA含量，進而緩解低氮造成的植株膜脂過氧化，提高大豆對低氮的耐受性。綜合不同濃度的作用效果，篩選出了緩解大豆低氮耐受性的適宜Trp濃度為 200 mg/L 。

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