摘要利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)金花茶（Camellianitidissima）的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，獲得了35個(gè)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子，將其分別命名為CnNAC1～CnNAC35；隨后分析了蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；利用RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在根、莖、葉、花等組織中的表達(dá)譜進(jìn)行了研究；并對(duì)金花茶不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣表達(dá)量與關(guān)鍵類黃酮化合物含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明：金花茶NAC基因家族成員編碼的蛋白主要為親水性的不穩(wěn)定蛋白，大多定位于細(xì)胞核或葉綠體中，多數(shù)蛋白都含有NAC基因家族所特有的5個(gè)亞保守結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化分析中，35個(gè)金花茶NAC蛋白被分為16個(gè)亞家族，而NAC2亞家族所包含的蛋白數(shù)量最多；金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)量存在差異，其中8個(gè)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在花瓣中的表達(dá)量相對(duì)較高，且與槲皮素、槲皮素-7-O-葡糖苷的變化量顯著相關(guān)。

關(guān)鍵詞金花茶；類黃酮合成調(diào)控；NAC基因家族；進(jìn)化分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)S685.14"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2025）02-0097-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.022

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

IdentificationandAnalysisofNACGeneFamilyinCamellianitidissimaBasedonFull-lengthTranscriptomeSequencing

LIUHe-xiaXUFei-feng2，YANGZhuo-ling2etal

（1.CollegeofSmartAgriculture，YulinNormalUniversity，Yulin，Guangxi537000;2.CollegeofBiologyandPharmacy，YulinNormalUniversity，Yulin，Guangxi537000）

AbstractInthisstudy，bioinformaticstechnologywasusedtoscreenthefull-lengthtranscriptomesequencingdataofCamellianitidissima，and35CnNACtranscriptionfactorswereobtained，whichwerenamedCnNAC1-CnNAC35respectively.Thephysicochemicalproperties，conserveddomainsandphylogeneticrelationshipsofCnNACproteinswereanalyzed.BasedonRNA-seqdata，theexpressionprofilesofCnNACtranscriptionfactorsinroot，stem，leafandflowerofCamellianitidissimawerestudied.Subsequently，PearsoncorrelationanalysiswasconductedbetweentheexpressiondataofCamellianitidissimapetalsandthecontentsofkeyflavonoidsindifferentfloweringperiods.TheresultsshowedthattheCnNACproteinsweremainlyhydrophilicandunstableproteinswhichweremainlylocatedinthenucleusorchloroplast，andmostoftheproteinscontained5subconserveddomainswhichwasspecialstructureintheNACgenefamily.Inphylogeneticanalysis，35CnNACproteinsweredividedinto16subfamilies，andNAC2subfamilycontainedthemostproteins.ThereweredifferencesintheexpressionlevelsofCnNACtranscriptionfactorsindifferenttissues，andtheexpressionlevelsof8CnNACtranscriptionfactorsinpetalswererelativelyhighwhichweresignificantlycorrelatedwiththechangesofquercetinandquercetin3-O-rhamnoside-7-O-glucoside.

KeywordsCamellianitidissima;Regulationofflavonoidsynthesis;NACgenefamily;Phylogeneticanalysis;Expressionanalysis

金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科山茶屬植物，其葉片及花朵中含有皂苷類、多糖、類黃酮等次生代謝物^［1-2］，可用于治療高血壓、痢疾、咽喉炎和便血等疾病^［3］。金花茶中富含的類黃酮化合物不僅是花色形成的關(guān)鍵物質(zhì)^［4-5］，還是其具有藥用價(jià)值的活性成分。近年來(lái)，金花茶中與類黃酮合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及少數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子已被克隆^［6-8］，部分基因的功能已被驗(yàn)證^{［6，8］}，金花茶類黃酮合成機(jī)理正在逐步闡明，但是bHLH、NAC、WD40等其他類別的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)金花茶中類黃酮合成的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。

NAC（NAM，ATAF1/ATAF2和CUC2）基因家族是植物中發(fā)現(xiàn)的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一^［9-10］，它們?cè)贜端具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約150個(gè)氨基酸殘基組成，主要包含5個(gè)保守區(qū)域（A～E）^［11-12］；C端區(qū)域富含簡(jiǎn)單的氨基酸重復(fù)序列及絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸殘基，是一個(gè)高度分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄激活或遏制蛋白活性的作用^［13-15］。NAC蛋白可與自身或其他NAC蛋白相互作用，形成同源二聚體或異源二聚體，它們互作的區(qū)域主要定位于N端的保守NAC結(jié)構(gòu)域^［16-17］；而通過(guò)蛋白互作形成的功能性NAC蛋白二聚體，其表面一側(cè)富含正電荷，該區(qū)域可能與DNA結(jié)合有關(guān)^［18-19］。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有廣泛的生物學(xué)功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝物質(zhì)合成、激素應(yīng)答、逆境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用^［20-21］。例如，MdNAC029轉(zhuǎn)錄因子可激活MdMYB1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)花青素在蘋(píng)果（Malus pumila）愈傷組織中合成^［22］；MdNAC52轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平在果實(shí)著色期間增加，過(guò)表達(dá)MdNAC52能夠促進(jìn)蘋(píng)果愈傷組織花色苷的積累^［23］。在金花茶不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中^［24-25］，發(fā)現(xiàn)部分金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在金花茶開(kāi)花過(guò)程中差異表達(dá)，它們可能具有調(diào)控金花茶中類黃酮合成的功能。目前，基于植物基因組學(xué)和生物信息學(xué)的手段，植物NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族的研究日益增多^［26-27］，但關(guān)于金花茶NAC基因家族以及NAC基因功能的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道，因此筆者基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息技術(shù)鑒定金花茶NAC基因家族，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析金花茶NAC基因家族成員在不同組織中的表達(dá)特征，并對(duì)它們的表達(dá)量與關(guān)鍵類黃酮化合物的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，以期篩選出在金花茶中具有調(diào)控類黃酮合成的NAC轉(zhuǎn)錄因子。該研究結(jié)果將為進(jìn)一步分析金花茶NAC基因功能及其在類黃酮合成中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//planttfdb.gao-lab.org/tf.php？sp=Athamp;did=AT5G62610.1）下載擬南芥NAC基因家族的蛋白編碼序列，然后將其作為搜尋序列（Querysequence），以金花茶的莖、葉以及不同開(kāi)花時(shí)期的花朵等組織的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（Accessionnumber：SRX18217210）作為目標(biāo)序列，搜索金花茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中所包含的NAC基因家族。

1.2方法

1.2.1金花茶NAC基因家族成員鑒定。

本地Blast搜索金花茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中的NAC基因家族，閾值 Elt;10^-5，用在線軟件NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）確定候選基因編碼的蛋白序列是否含有NAC蛋白保守結(jié)構(gòu)域，排除不符合要求的基因。

1.2.2金花茶NAC蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域以及保守結(jié)構(gòu)元件分析。

通過(guò)在線網(wǎng)站ExPASy（http：//web.expasy.org/prot-param/）完成對(duì)金花茶NAC基因家族成員蛋白質(zhì)的性質(zhì)的分析，如等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水系數(shù)、分子量等；同時(shí)利用在線網(wǎng)站W(wǎng)OLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/）預(yù)測(cè)金花茶NAC基因家族成員的保守基序，其中Motifs數(shù)量設(shè)定為10個(gè)，保守位點(diǎn)寬度為6～50，其余參數(shù)不變；通過(guò)TBtools軟件繪制展示結(jié)果。對(duì)于金花茶NAC蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析，則利用DNAMAN9.0軟件對(duì)金花茶NAC蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，分析它們保守結(jié)構(gòu)域的完整性。

1.2.3金花茶NAC基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

采用Neighbor-joining方法，構(gòu)建金花茶NAC基因家族與擬南芥NAC基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，該過(guò)程主要利用MEGA10軟件完成，其中Boot-strap值設(shè)為1000，而其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.2.4金花茶NAC基因家族表達(dá)模式分析及相關(guān)性分析。

利用金花茶根、莖、葉、不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣、不同發(fā)育時(shí)期花芽的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析金花茶NAC基因家族在不同組織中的表達(dá)量，然后使用R語(yǔ)言軟件中的Heatmap工具繪制表達(dá)量熱圖；并將金花茶不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣表達(dá)量與槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、槲皮素-7-O-葡糖苷（Quercetin-3-O-rhamnoside-7-O-glucoside，Qu7G）、槲皮素-3-O-葡糖苷（Quercetin-3-O-glucoside，Qu3G）等類黃酮化合物的含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究NAC基因的表達(dá)量與關(guān)鍵類黃酮化合物之間的相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1金花茶NAC基因家族的篩選及蛋白特性預(yù)測(cè)

利用生物信息學(xué)技術(shù)手段，在金花茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得35個(gè)有完整ORF的NAC基因家族成員，分別將其命名為CnNAC1～CnNAC35（表1）；其中CnNAC03的氨基酸序列最長(zhǎng)，有638個(gè)氨基酸殘基，CnNAC35的氨基酸序列最短，僅有292個(gè)氨基酸殘基。對(duì)35個(gè)金花茶NAC蛋白的物理特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們的分子量分布范圍為33.30～71.56kD，等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）的分布范圍在4.62～8.98，其中26個(gè)為酸性蛋白，9個(gè)為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為33.31～54.42，其中17個(gè)屬于穩(wěn)定蛋白，18個(gè)屬于不穩(wěn)定蛋白；而金花茶NAC蛋白的平均親水指數(shù)分布范圍為-0.892～-0.295，結(jié)果表明所有金花茶CnNAC蛋白均為親水性蛋白；它們的脂肪系數(shù)為55.65～75.50。對(duì)35個(gè)金花茶NAC蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，顯示這些蛋白主要分布在細(xì)胞核和葉綠體中，少數(shù)定位在液泡、質(zhì)體和高爾基體中。

2.2金花茶NAC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及保守基序分析

對(duì)金花茶CnNAC的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明，大部分金花茶CnNAC蛋白均含有完整的5個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域，只有少數(shù)CnNAC蛋白所含的保守亞結(jié)構(gòu)域不完整，它們?nèi)笔Я似渲械?～3個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域（圖1）。如CnNAC31缺失了1個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域C，CnNAC34缺失了1個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域B；CnNAC02、CnNAC20、CnNAC22、CnNAC23、CnNAC24、CnNAC29都缺少了2個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域C和E；而CnNAC13蛋白缺少了3個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域B、C和E。

利用MEME在線工具對(duì)金花茶CnNAC蛋白的保守基序進(jìn)行分析，設(shè)定篩選的保守基序數(shù)量為10，將它們分別被命名為Motif1～Motif10，結(jié)果表明：35個(gè)金花茶CnNAC蛋白保守基序的長(zhǎng)度分布范圍為21～51個(gè)氨基酸，而CnNAC蛋白中包含的保守基序數(shù)目為2～10個(gè)（圖2）。比對(duì)金花茶NAC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與保守基序的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Motif2代表NAC蛋白的保守亞結(jié)構(gòu)域A，Motif4為保守亞結(jié)構(gòu)域B，Motif3為保守亞結(jié)構(gòu)域C，Motif1為保守亞結(jié)構(gòu)域D，Motif5為保守亞結(jié)構(gòu)域E，大多數(shù)金花茶CnNAC蛋白都含有上述5個(gè)保守基序，只有少數(shù)CnNAC蛋白缺失了其中1～3個(gè)基序。另外，綜合金花茶NAC基因家族的進(jìn)化分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)屬于同一亞組的NAC基因家族成員的Motif組成類型相似，推測(cè)它們可能具有相似的功能。

2.3金花茶NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建金花茶NAC蛋白與擬南芥NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，研究結(jié)果表明，該系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)共劃分為16個(gè)亞家族（圖3），35個(gè)金花茶NAC蛋白分布在NAC2、TIP、OsNAC8、NAM、OSNAC7、NAP/ANAC3、ATAF、ANAC001、UN和ONAC00310個(gè)亞族中，而在ANAC011、ANAC063-a、NAC1、SEUN5、ONAC22及ANAC063-b6個(gè)亞家族中未發(fā)現(xiàn)金花茶NAC蛋白。NAC2亞家族所包含的金花茶NAC蛋白數(shù)量最多，共有12個(gè)，占總數(shù)的34.28%；其次為ANAC001亞家族、TIP亞家族、NAP/ANAC3亞家族、OsNAC8及NAM亞家族，它們含有的NAC蛋白數(shù)量分別為7、4、4、2、2個(gè)；而OSNAC7、ATAF、UN及ONAC003亞家族則各有1個(gè)。

2.4金花茶NAC基因的表達(dá)及相關(guān)分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將35個(gè)金花茶NAC基因在花瓣、花芽、根、莖及葉等組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果表明，35個(gè)金花茶NAC基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異，它們的表達(dá)情況大致可分為4種類型（圖4），第1種表達(dá)類型是部分金花茶NAC基因在花瓣、花芽、根、莖、葉中的表達(dá)量都很低，如，CnNAC34、CnNAC02、CnNAC22、CnNAC23、CnNAC24、CnNAC25、CnNAC07、CnNAC28、CnNAC17、CnNAC19等；第2種表達(dá)類型是CnNAC32、CnNAC35在花瓣、花芽、根、莖、葉等組織中都高度表達(dá)；第3種表達(dá)類型是CnNAC16、CnNAC30、CnNAC18、CnNAC06、CnNAC10、CnNAC01、CnNAC05、CnNAC03、CnNAC12等基因主要在花瓣中高表達(dá)，而在其他部位中表達(dá)量較低；第4種類型是CnNAC27、CnNAC15、CnNAC09、CnNAC20、CnNAC11、CnNAC14、CnNAC21、CnNAC29、CnNAC26、CnNAC13、CnNAC31、CnNAC33、CnNAC04、CnNAC08等基因主要在根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官中高表達(dá)。此外，將金花茶NAC基因在花瓣中的表達(dá)量與槲皮素、山奈酚、Qu7G、Qu3G的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CnNAC11、CnNAC13、CnNAC14、CnNAC15、CnNAC31、CnNAC32等基因的表達(dá)量與槲皮素含量為負(fù)相關(guān)，而CnNAC32、CnNAC33的表達(dá)量則與Qu7G含量為正相關(guān)，且它們的相關(guān)性均達(dá)到了顯著水平（圖5）。

3討論

該研究從金花茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定出35個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量與矮牽牛的NAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量相似^［28］，而與雙子葉模式植物擬南芥、單子葉模式植物水稻以及近緣物種茶樹(shù)的NAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目相比^［29］，金花茶NAC基因家族數(shù)量則相對(duì)較少，推測(cè)其原因，可能是物種差異所造成。NAC蛋白的N端結(jié)構(gòu)域被細(xì)分為A、B、C、D、E 5個(gè)亞保守結(jié)構(gòu)域，其中A、C、D亞保守結(jié)構(gòu)域高度保守，B、E亞保守結(jié)構(gòu)域的保守性較低，推斷B、E亞保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列差異可能是導(dǎo)致植物NAC基因功能多樣性的主要原因^［30］。該研究通過(guò)對(duì)金花茶NAC蛋白進(jìn)行序列比對(duì)及保守基序分析，發(fā)現(xiàn)所有金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子都含有NAC基因家族N端所特有的A、D亞結(jié)構(gòu)域，2個(gè)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子不含B亞結(jié)構(gòu)域，8個(gè)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子不含C亞結(jié)構(gòu)域，7個(gè)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子不含E亞結(jié)構(gòu)域，表明金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子的A、D亞結(jié)構(gòu)域序列高度保守，B亞結(jié)構(gòu)域序列比較保守，而C、E亞結(jié)構(gòu)域序列保守性相對(duì)較低，因此推斷金花茶中C、E亞保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列差異可能是導(dǎo)致金花茶NAC蛋白功能多樣性的原因之一，這與Mohanta等^［31］的研究結(jié)果存在差異。

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Ooka等^［32］ 研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥NAC基因家族和水稻NAC基因家族主要分成兩大類，共18個(gè)亞族。而系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，35個(gè)金花茶NAC基因家族成員在10個(gè)亞家族中均有分布，且在NAC2亞族中的分布數(shù)量最多；卓茂根等^［33］在對(duì)368個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析中也獲得了類似結(jié)果。

對(duì)金花茶NAC基因在花瓣、花芽、根、莖及葉等組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CnNAC01、CnNAC03、CnNAC05、CnNAC06、CnNAC10、CnNAC12、CnNAC16、CnNAC18、CnNAC30等轉(zhuǎn)錄因子主要在花瓣中高表達(dá)；且部分在金花茶花瓣中中度表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子，如CnNAC11、CnNAC13、CnNAC14、CnNAC15、CnNAC32、CnNAC33等，與花瓣中關(guān)鍵類黃酮化合物的含量具有顯著相關(guān)性。金花茶花瓣中富含類黃酮物質(zhì)^［34］，而NAC轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控類黃酮物質(zhì)合成的作用，如，該研究中金花茶CnNAC11轉(zhuǎn)錄因子被注釋為AtNAC072，已有研究發(fā)現(xiàn)與其互為同源基因的越橘VcNAC072轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，可顯著促進(jìn)擬南芥AtPAP1轉(zhuǎn)錄因子及花青素合成基因的表達(dá)，表明VcNAC072可能具有促進(jìn)越橘花青素合成的作用^［35］；金花茶CnNAC16轉(zhuǎn)錄因子被注釋為AtNAC056，與其互為同源基因的紅薯IbNAC56轉(zhuǎn)錄因子可與IbMYB340、IbbHLH2轉(zhuǎn)錄因子形成MYB340-bHLH2-NAC56蛋白復(fù)合體來(lái)調(diào)控IbANS基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控花色素苷的合成^［36］，因此推斷上述中高度表達(dá)的金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在花瓣中可能具有調(diào)控類黃酮物質(zhì)合成的功能，但它們的具體功能仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選獲得了金花茶NAC基因家族，明確了該基因家族的分子特征、保守結(jié)構(gòu)域類型和系統(tǒng)進(jìn)化特征，揭示了NAC基因家族成員在金花茶不同組織中的表達(dá)模式，以及與關(guān)鍵類黃酮化合物的相關(guān)性，豐富了金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子研究，為后續(xù)金花茶NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究功能及其在類黃酮合成調(diào)控中的作用機(jī)制提供支撐。

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