肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　秦云霞　黃亞成　唐朝榮

摘 要 鈣/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶（CCaMK，calcium- and calmodulin-dependent protein kinase）是一種鈣離子結合蛋白，在鈣信號傳導過程中起重要作用。本研究以已發(fā)表的CCaMK序列作為檢索序列，對橡膠樹和其他5種植物（木薯、水稻、楊樹、蓖麻和擬南芥）的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行全面搜索，鑒定得到6個CCaMK基因，其中包括一個橡膠樹CCaMK基因，命名為HbCCaMK1。序列分析發(fā)現(xiàn)：5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高，為73%～94%?；蚪Y構分析發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1和所分析的其他植物CCaMK一樣均，含有6個內(nèi)含子、1個蛋白激酶結構域和3個EF-hand結構域；從結構和進化上看，HbCCaMK1和蓖麻、木薯2種植物的CCaMK具有較近的親緣關系；在表達方面，HbCCaMK1在橡膠樹根中表達豐度最高，其次為樹葉和花；另外，HbCCaMK1的表達還與葉片發(fā)育、真菌侵染和低溫脅迫有關。

關鍵詞 巴西橡膠樹 ；CCaMK ；基因家族 ；結構與進化 ；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.004

所有生物都依賴于復雜的信號傳遞網(wǎng)絡來調(diào)控自身代謝和對環(huán)境的適應性。在眾多信號傳遞途徑中，鈣離子作為細胞內(nèi)第二信使發(fā)揮著重要作用[1-3]。一些鈣離子感受器或鈣離子結合蛋白能夠識別瞬間鈣離子濃度的變化，進而誘導下游蛋白質(zhì)磷酸化方式和基因表達模式的改變[2]，實現(xiàn)植物對外界環(huán)境變化的應答。在植物中己鑒定的鈣離子結合蛋白包括4種：鈣調(diào)素（calmodulins，CaM）、鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPKs）、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（CCaMKs）和鈣調(diào)磷酸酯酶B類蛋白。CCaMK基因編碼的蛋白包含4個結構域，分別為N-末端結構域、蛋白激酶結構域、CaM結合域和EF手性結構域。在植物中，已經(jīng)從煙草、玉米、百合、百脈根、豌豆等多種植物中鑒定出CCaMK。研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK廣泛參與植物光信號傳導、花藥發(fā)育、寄主與病原的互作及逆境脅迫等多種生物學過程[4-7]。但在橡膠樹和木薯等大戟科植物中卻未見CCaMK相關研究的報道。本研究以已發(fā)表的CCaMK氨基酸序列為探針，對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻共6種植物的基因組數(shù)據(jù)進行全面搜索，鑒定得到6個CCaMK基因家族成員，其中橡膠樹、木薯、水稻等植物中僅有一個成員，而擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)CCaMK成員。利用相關軟件和數(shù)據(jù)庫對這些家族成員的基因結構、進化和表達水平等進行了系統(tǒng)分析。本研究結果將有助于深入了解橡膠樹CCaMK的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗室Solexa測序所用材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）‘熱研7-33-97，除了根取自組培苗（由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈送的‘熱研 7-33-9組培苗）外，其他組織（包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花）均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場三隊的正常割膠橡膠樹（開割2年以上）；不同發(fā)育時期的橡膠樹葉片取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠所種質(zhì)資源圃，為1年生的‘熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要來自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場三隊，品系為熱研7-33-9，正常開割樹（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用 1.5% 乙烯利分別在不同時間處理橡膠樹，相應4個時間點為0、3、12和 24 h，具體方法參照文獻[8]進行。

網(wǎng)上測序數(shù)據(jù)來自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同組織（PRJNA201084）、真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078）和乙烯利處理（PRJNA182079）等的數(shù)據(jù)，詳細信息參見數(shù)據(jù)庫中實驗說明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析

為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的CCaMK基因家族成員，從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；以已發(fā)表的CCaMK序列為探針[4-7]，對6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行搜索，得到候選CCaMK基因家族成員，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對候選基因的結構域進行分析；再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對基因的等電點和分子量進行批量分析。

1.2.2 基因結構與進化分析

利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對橡膠樹和其他5種植物CCaMK基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結構進行分析。利用MEGA 6.0軟件構建橡膠樹和其他5種植物的CCaMK氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining方法進行分子系統(tǒng)學分析，進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

1.2.3 基因的表達模式分析

利用本實驗室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對橡膠樹CCaMK基因家族成員的表達模式進行分析[9]：將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中與橡膠樹相關的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務器，去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進行表達分析[10]。

2 結果與分析

2.1 CCaMK基因的鑒定與序列分析

本研究以已發(fā)表的玉米等植物的CCaMK基因氨基酸序列為探針，利用tblastn搜索橡膠樹、木薯、蓖麻、水稻、楊樹和擬南芥6種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，共鑒定得到了6個CCaMK基因（表1），橡膠樹、木薯、水稻和蓖麻中均僅有1個，楊樹中有2個，但在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)同源基因，將橡膠樹的CCaMK基因命名為HbCCaMK1。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbCCaMK1基因編碼510個氨基酸，分子量為57 ku，等電點為5.6，有6個內(nèi)含子。通過氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，橡膠樹CCaMK含有多個保守的蛋白激酶和EF-hand結構域（圖 1）。序列分析發(fā)現(xiàn)，5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高，為73%～94%。

2.2 基因結構和進化分析

利用在線軟件GSDS對橡膠樹和其他4種植物CCaMK基因的外顯子/內(nèi)含子組織結構進行了分析，并結合各家族成員在進化上的相互關系進行作圖（圖 2）。分析發(fā)現(xiàn)，所分析的5種植物各家族成員，都含有6個內(nèi)含子、1個蛋白激酶結構域和3個EF-hand 結構域，這和先前研究的CCaMK結構特征一致[4-7]。橡膠樹、木薯和蓖麻3種植物CCaMK基因外顯子/內(nèi)含子的組織結構和結構域在外顯子上的相對位置具有更高的相似性，在進化樹上HbCCaMK1和MeCCaMK1聚在一起，說明它們具有更近的親緣關系。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，楊樹的PtCCaMK2基因結構和結構域的相對位置與該物種中的另一個成員PtCCaMK1以及其他物種的CCaMK成員相比均具有較大差異，推測該基因在進化過程中發(fā)生了較大的變異。

2.3 橡膠樹CCaMK基因的表達分析

利用本實驗室現(xiàn)有的Solexa測序數(shù)據(jù)對HbCCaMK1在不同組織、不同葉片發(fā)育時期和乙烯利處理下的表達模式進行了分析。結果（圖 3）表明，HbCCaMK1在根中的表達豐度最高，遠高于其他組織，在花中的表達豐度也較高，而在膠乳中的表達豐度最低；隨葉片的發(fā)育，HbCCaMK1的表達呈明顯的上升趨勢；在乙烯利處理前后，HbCCaMK1在膠乳中的表達豐度都特別低，幾乎不表達。

本研究還利用NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對HbCCaMK1基因在不同實驗條件下的表達情況進行了分析。結果（圖4）表明，HbCCaMK1在所分析的樹葉、樹皮和膠乳等3種組織中表達豐度普遍較低，其中在葉片中的表達遠低于樹皮，這與利用本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結果不太一致（圖3）；乙烯利處理前后，HbCCaMK1在膠乳中的表達都很低，這與基于本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結果一致；C. cassiicola侵染和低溫脅迫處理可以誘導HbCCaMK1在葉片中的表達。

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK廣泛參與植物的生長發(fā)育及與逆境脅迫相關的多種生物學過程[4-7]。本研究通過對6種不同植物進行全基因組搜索，共鑒定出6個CCaMK基因家族成員，其中在擬南芥中未能搜索到CCaMK。在結構域方面，CCaMK和CDPK相比主要少了第一個EF-hand結構域[11]，推測CCaMK與CDPK具有較近的親緣關系和類似的功能，而在擬南芥中，CDPK家族基因的某些成員可能承擔了與其它植物中CCaMK基因一樣的功能。通過基因結構和進化方面的比較，發(fā)現(xiàn)HbCCaMK1與木薯、蓖麻CCaMK基因具有更近的親緣關系，這與橡膠、木薯、蓖麻同屬大戟科的結論一致。本研究充分利用現(xiàn)有的Solexa測序數(shù)據(jù)對HbCCaMK1的表達情況進行全面的分析。結果發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1在根中的表達豐度遠遠高于其他組織（圖3）。有研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK基因在苜蓿和百脈根中的表達豐度也最高，并且發(fā)現(xiàn)CCaMK基因在植物與細菌、真菌共生過程中起作用，同時與根瘤的形成有關[7，12]。據(jù)此可推測，HbCCaMK1很可能在橡膠樹和根際微生物（細菌、真菌）的共生中起作用，同時在根瘤形成中發(fā)揮重要作用。在葉片發(fā)育過程中，HbCCaMK1的表達豐度呈上升趨勢，說明該基因可能與橡膠樹葉片的光信號應答及傳導有一定的相關性。本研究還發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1的表達受真菌侵染和低溫等逆境脅迫處理的誘導，表明該基因可能參與相關應答反應，在其它植物的CCaMK基因研究中也有類似的報道[4-7]。

另外，本實驗室的高通量數(shù)據(jù)已被成功應用于橡膠樹基因組數(shù)據(jù)的分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族的相關分析，相關結果已發(fā)表在Nature Plants[13]和 Febs Journal[9]，這進一步證實了本研究結果的可靠性。綜上所述，本研究首次從橡膠樹中鑒定出一個CCaMK基因HbCCaMK1，并從基因結構、進化和表達等方面對其進行了初步分析，研究結果將為進一步研究HbCCaMK1在橡膠樹中的功能奠定基礎。

參考文獻

[1] Trewavas A J， Malho R. Signal Perception and Transduction： The Origin of the Phenotype[J]. Plant Cell， 1997， 9（9）： 1 181-1 195.

[2] Sanders D， Harper J， Brownlee C. Communicating with calcium[J]. Plant Cell， 1999， 11（4）： 691-706.

[3] Berridge M J， Lipp P， Bootman M D. The versatility and universality of calcium signalling[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2000， 1（1）：11-21.

[4] Pandey S， Sopory S K. Biochemical evidence for a calmodulin-stimulated calcium-dependent protein kinase in maize[J]. European Journal of Biochemistry， 1998， 255（3）： 718-726.

[5] Poovaiah B W， Xia M ， Liu Z ， et al. Developmental regulation of the gene for chimeric calcium/calmodulin-dependent protein kinase in anthers[J]. Planta， 1999， 209（2）： 161-171.

[6] Liu Z， Xia M， Poovaiah B W. Chimeric calcium/calmodulin-dependent protein kinase in tobacco： differential regulation by calmodulin isoforms[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 38（5）： 889-897.

[7] LeLa T， Haruko I A， Satoko Y， et al. Deregulation of a Ca2+/calmodulin-dependent kinase leads to spontaneous nodule development[J]. Nature， 2006， 441（7 097）： 1153-1156.

[8] 肖小虎. 巴西橡膠樹蔗糖代謝相關基因家族的克隆、結構進化和表達分析[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W，2013.

[9] Xiao X H， Tang C R， Fang Y J， et al. Structure and expression profile of the sucrose synthase gene family in the rubber tree： indicative of roles in stress response and sucrose utilization in the laticifers[J]. Febs Journal， 2014， 281（1）： 291-305.

[10] Li B， Dewey C N. RSEM： accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics， 2011， 12（1）： 93-99.

[11] Hrabak E M， Chan C W M， Michael G， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J]. Plant Physiology， 2003， 132（2）： 666-680.

[12] Sun J， Oldroyd G E D. Mastoparan activates calcium spiking analogous to Nod factor-induced responses in Medicago truncatula root hair cells[J]. Plant Physiology， 2007， 144（2）： 695-702.

[13] Tang C， Meng Y， Fang Y， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16 073 .