肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　秦云霞　黃亞成　唐朝榮

摘 要 鈣/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶（CCaMK，calcium- and calmodulin-dependent protein kinase）是一種鈣離子結(jié)合蛋白，在鈣信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。本研究以已發(fā)表的CCaMK序列作為檢索序列，對(duì)橡膠樹(shù)和其他5種植物（木薯、水稻、楊樹(shù)、蓖麻和擬南芥）的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面搜索，鑒定得到6個(gè)CCaMK基因，其中包括一個(gè)橡膠樹(shù)CCaMK基因，命名為HbCCaMK1。序列分析發(fā)現(xiàn)：5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高，為73%～94%?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1和所分析的其他植物CCaMK一樣均，含有6個(gè)內(nèi)含子、1個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和3個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域；從結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上看，HbCCaMK1和蓖麻、木薯2種植物的CCaMK具有較近的親緣關(guān)系；在表達(dá)方面，HbCCaMK1在橡膠樹(shù)根中表達(dá)豐度最高，其次為樹(shù)葉和花；另外，HbCCaMK1的表達(dá)還與葉片發(fā)育、真菌侵染和低溫脅迫有關(guān)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù) ；CCaMK ；基因家族 ；結(jié)構(gòu)與進(jìn)化 ；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.004

所有生物都依賴于復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控自身代謝和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。在眾多信號(hào)傳遞途徑中，鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)第二信使發(fā)揮著重要作用[1-3]。一些鈣離子感受器或鈣離子結(jié)合蛋白能夠識(shí)別瞬間鈣離子濃度的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)下游蛋白質(zhì)磷酸化方式和基因表達(dá)模式的改變[2]，實(shí)現(xiàn)植物對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)答。在植物中己鑒定的鈣離子結(jié)合蛋白包括4種：鈣調(diào)素（calmodulins，CaM）、鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPKs）、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（CCaMKs）和鈣調(diào)磷酸酯酶B類(lèi)蛋白。CCaMK基因編碼的蛋白包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N-末端結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、CaM結(jié)合域和EF手性結(jié)構(gòu)域。在植物中，已經(jīng)從煙草、玉米、百合、百脈根、豌豆等多種植物中鑒定出CCaMK。研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK廣泛參與植物光信號(hào)傳導(dǎo)、花藥發(fā)育、寄主與病原的互作及逆境脅迫等多種生物學(xué)過(guò)程[4-7]。但在橡膠樹(shù)和木薯等大戟科植物中卻未見(jiàn)CCaMK相關(guān)研究的報(bào)道。本研究以已發(fā)表的CCaMK氨基酸序列為探針，對(duì)橡膠樹(shù)、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹(shù)和水稻共6種植物的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面搜索，鑒定得到6個(gè)CCaMK基因家族成員，其中橡膠樹(shù)、木薯、水稻等植物中僅有一個(gè)成員，而擬南芥中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CCaMK成員。利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些家族成員的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)水平等進(jìn)行了系統(tǒng)分析。本研究結(jié)果將有助于深入了解橡膠樹(shù)CCaMK的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)室Solexa測(cè)序所用材料為巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）‘熱研7-33-97，除了根取自組培苗（由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈(zèng)送的‘熱研 7-33-9組培苗）外，其他組織（包括膠乳、樹(shù)皮、樹(shù)葉、種子、雌花和雄花）均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)的正常割膠橡膠樹(shù)（開(kāi)割2年以上）；不同發(fā)育時(shí)期的橡膠樹(shù)葉片取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃，為1年生的‘熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要來(lái)自海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)，品系為熱研7-33-9，正常開(kāi)割樹(shù)（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用 1.5% 乙烯利分別在不同時(shí)間處理橡膠樹(shù)，相應(yīng)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)為0、3、12和 24 h，具體方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

網(wǎng)上測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同組織（PRJNA201084）、真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078）和乙烯利處理（PRJNA182079）等的數(shù)據(jù)，詳細(xì)信息參見(jiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析

為了全面鑒定橡膠樹(shù)、擬南芥、楊樹(shù)、水稻、木薯和蓖麻的CCaMK基因家族成員，從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫(kù)下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；以已發(fā)表的CCaMK序列為探針[4-7]，對(duì)6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行搜索，得到候選CCaMK基因家族成員，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對(duì)候選基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫(kù)的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對(duì)基因的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行批量分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析

利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)橡膠樹(shù)和其他5種植物CCaMK基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建橡膠樹(shù)和其他5種植物的CCaMK氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.3 基因的表達(dá)模式分析

利用本實(shí)驗(yàn)室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)橡膠樹(shù)CCaMK基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析[9]：將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中與橡膠樹(shù)相關(guān)的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務(wù)器，去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進(jìn)行表達(dá)分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCaMK基因的鑒定與序列分析

本研究以已發(fā)表的玉米等植物的CCaMK基因氨基酸序列為探針，利用tblastn搜索橡膠樹(shù)、木薯、蓖麻、水稻、楊樹(shù)和擬南芥6種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，共鑒定得到了6個(gè)CCaMK基因（表1），橡膠樹(shù)、木薯、水稻和蓖麻中均僅有1個(gè)，楊樹(shù)中有2個(gè)，但在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)同源基因，將橡膠樹(shù)的CCaMK基因命名為HbCCaMK1。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)HbCCaMK1基因編碼510個(gè)氨基酸，分子量為57 ku，等電點(diǎn)為5.6，有6個(gè)內(nèi)含子。通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)CCaMK含有多個(gè)保守的蛋白激酶和EF-hand結(jié)構(gòu)域（圖 1）。序列分析發(fā)現(xiàn)，5種植物的CCaMK氨基酸序列同源性較高，為73%～94%。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

利用在線軟件GSDS對(duì)橡膠樹(shù)和其他4種植物CCaMK基因的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并結(jié)合各家族成員在進(jìn)化上的相互關(guān)系進(jìn)行作圖（圖 2）。分析發(fā)現(xiàn)，所分析的5種植物各家族成員，都含有6個(gè)內(nèi)含子、1個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和3個(gè)EF-hand 結(jié)構(gòu)域，這和先前研究的CCaMK結(jié)構(gòu)特征一致[4-7]。橡膠樹(shù)、木薯和蓖麻3種植物CCaMK基因外顯子/內(nèi)含子的組織結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域在外顯子上的相對(duì)位置具有更高的相似性，在進(jìn)化樹(shù)上HbCCaMK1和MeCCaMK1聚在一起，說(shuō)明它們具有更近的親緣關(guān)系。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)的PtCCaMK2基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置與該物種中的另一個(gè)成員PtCCaMK1以及其他物種的CCaMK成員相比均具有較大差異，推測(cè)該基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了較大的變異。

2.3 橡膠樹(shù)CCaMK基因的表達(dá)分析

利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)HbCCaMK1在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖 3）表明，HbCCaMK1在根中的表達(dá)豐度最高，遠(yuǎn)高于其他組織，在花中的表達(dá)豐度也較高，而在膠乳中的表達(dá)豐度最低；隨葉片的發(fā)育，HbCCaMK1的表達(dá)呈明顯的上升趨勢(shì)；在乙烯利處理前后，HbCCaMK1在膠乳中的表達(dá)豐度都特別低，幾乎不表達(dá)。

本研究還利用NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)HbCCaMK1基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖4）表明，HbCCaMK1在所分析的樹(shù)葉、樹(shù)皮和膠乳等3種組織中表達(dá)豐度普遍較低，其中在葉片中的表達(dá)遠(yuǎn)低于樹(shù)皮，這與利用本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果不太一致（圖3）；乙烯利處理前后，HbCCaMK1在膠乳中的表達(dá)都很低，這與基于本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致；C. cassiicola侵染和低溫脅迫處理可以誘導(dǎo)HbCCaMK1在葉片中的表達(dá)。

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及與逆境脅迫相關(guān)的多種生物學(xué)過(guò)程[4-7]。本研究通過(guò)對(duì)6種不同植物進(jìn)行全基因組搜索，共鑒定出6個(gè)CCaMK基因家族成員，其中在擬南芥中未能搜索到CCaMK。在結(jié)構(gòu)域方面，CCaMK和CDPK相比主要少了第一個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域[11]，推測(cè)CCaMK與CDPK具有較近的親緣關(guān)系和類(lèi)似的功能，而在擬南芥中，CDPK家族基因的某些成員可能承擔(dān)了與其它植物中CCaMK基因一樣的功能。通過(guò)基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化方面的比較，發(fā)現(xiàn)HbCCaMK1與木薯、蓖麻CCaMK基因具有更近的親緣關(guān)系，這與橡膠、木薯、蓖麻同屬大戟科的結(jié)論一致。本研究充分利用現(xiàn)有的Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)HbCCaMK1的表達(dá)情況進(jìn)行全面的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1在根中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織（圖3）。有研究發(fā)現(xiàn)，CCaMK基因在苜蓿和百脈根中的表達(dá)豐度也最高，并且發(fā)現(xiàn)CCaMK基因在植物與細(xì)菌、真菌共生過(guò)程中起作用，同時(shí)與根瘤的形成有關(guān)[7，12]。據(jù)此可推測(cè)，HbCCaMK1很可能在橡膠樹(shù)和根際微生物（細(xì)菌、真菌）的共生中起作用，同時(shí)在根瘤形成中發(fā)揮重要作用。在葉片發(fā)育過(guò)程中，HbCCaMK1的表達(dá)豐度呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明該基因可能與橡膠樹(shù)葉片的光信號(hào)應(yīng)答及傳導(dǎo)有一定的相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，HbCCaMK1的表達(dá)受真菌侵染和低溫等逆境脅迫處理的誘導(dǎo)，表明該基因可能參與相關(guān)應(yīng)答反應(yīng)，在其它植物的CCaMK基因研究中也有類(lèi)似的報(bào)道[4-7]。

另外，本實(shí)驗(yàn)室的高通量數(shù)據(jù)已被成功應(yīng)用于橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)的分析以及橡膠樹(shù)蔗糖合成酶基因家族的相關(guān)分析，相關(guān)結(jié)果已發(fā)表在Nature Plants[13]和 Febs Journal[9]，這進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果的可靠性。綜上所述，本研究首次從橡膠樹(shù)中鑒定出一個(gè)CCaMK基因HbCCaMK1，并從基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)等方面對(duì)其進(jìn)行了初步分析，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究HbCCaMK1在橡膠樹(shù)中的功能奠定基礎(chǔ)。

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