摘要：目的 探討漆黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NOD樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化緩解膿毒癥后認(rèn)知功能損害的機(jī)制。方法 選用C57BL/6小鼠，用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒癥模型。分組包括：假手術(shù)組、膿毒癥組、膿毒癥+胱天蛋白酶（caspase）-1敲除組（膿毒癥+Cas-1-/-組）、膿毒癥+漆黃素組。Morris水迷宮評(píng)估小鼠的認(rèn)知功能。Western blot和免疫熒光雙染檢測(cè)腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白caspase-1、GSDMD蛋白N端片段（GSDMD-N）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18，線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅱ的表達(dá)。用伊文思藍(lán)檢測(cè)血腦屏障的通透性。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，膿毒癥組caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；膿毒癥+Cas-1-/-組caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）。膿毒癥+漆黃素組Pink1、Parkin和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯高于膿毒癥組（P＜0.05），caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）。與膿毒癥組相比，膿毒癥+漆黃素組伊文思藍(lán)滲漏減少、逃逸潛伏期縮短和穿越平臺(tái)次數(shù)增加（均P＜0.05）。結(jié)論 漆黃素可能通過Pink1/Parkin通路激活線粒體自噬，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)而緩解膿毒癥后中樞炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損害。

關(guān)鍵詞：膿毒癥；認(rèn)知功能障礙；線粒體自噬；NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3；漆黃素

中圖分類號(hào)：R515.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240619

Study on the effect of fisetin on alleviating cognitive impairment after sepsis by inhibiting the activation of microglial NLPR3 inflammasome

LIAO Zhong1， LIAO Weijian1， LAI Guoli1， WEN Yin2， SU Zhiwei2， ZENG Juhao2， DING Hongguang3

1 Department of Emergency， Longnan First People’s Hospital， Longnan 341700， China; 2 Department of Critical Care

Medicine， 3 Department of Emergency， Guangdong Provincial People’s Hospital （Guangdong Academy of

Medical Sciences）， Southern Medical University

Abstract： Objective To investigate the mechanism of fisetin inhibiting the activation of microglia NOD-like receptor family protein 3 （NLRP3） inflammasome in microglia and alleviating cognitive impairment after sepsis. Methods C57BL/6 mice were used to establish the sepsis model by cecal ligation and puncture. Mice were divided into four groups： the sham group， the sepsis group， the sepsis+caspase-1 knockout group （sepsis+Cas-1-/- group） and the sepsis+fisetin group. Evans blue was used to detect the permeability of blood-brain barrier （BBB）. Morris water maze was used to evaluate the cognitive function of mice. Western blot assay and immunofluorescence double staining were used to detect the expression of NLRP3 inflammasome-related proteins including caspase-1， N-terminal fragment of the GSDMD （GSDMD-N）， interleukin （IL）-1β， IL-18 and mitophagy-related proteins （Pink1， Parkin and LC3-Ⅱ） in brain tissue and microglia. Results Compared with the sham group， expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly increased in the sepsis group （P＜0.05）. Compared with the sepsis group， expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly decreased in the sepsis+Cas-1-/- group （P＜0.05）. The expression levels of Pink1， Parkin and LC3-Ⅱ were significantly higher in the sepsis+fisetin group than those of the sepsis group （P＜0.05）， and expression levels of caspase-1， GSDMD-N， IL-1β and IL-18 were significantly lower （P＜0.05）. After fisetin intervention， the permeability of BBB was decreased and the cognitive impairment （decreased escape latency and increased frequencies of crossing the platform） was alleviated in the sepsis+fisetin group compared with those of the sepsis group （P＜0.05）. Conclusion Fisetin may alleviate central inflammation and cognitive impairment after sepsis by inhibiting the activation of microglial NLRP3 inflammasome through activating mitophagy.

Key words： sepsis; cognitive dysfunction; mitophagy; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; fisetin

膿毒癥是發(fā)病率較高的重癥疾病，常伴有多器官功能損傷。膿毒癥早期累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)為膿毒癥相關(guān)性腦病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）［1］，并發(fā)SAE可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損害和病死率增加［2］。SAE嚴(yán)重影響膿毒癥患者的預(yù)后。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，膿毒癥時(shí)其作用表現(xiàn)為：一方面釋放炎性因子和氧自由基等分子，介導(dǎo)神經(jīng)毒性；另一方面吞噬細(xì)胞碎片、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)［3-5］。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的中樞炎癥反應(yīng)可緩解膿毒癥誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害。目前尚缺乏能有效緩解膿毒癥誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害的方法。漆黃素是一種膳食多酚類黃酮，在蔬菜和水果中廣泛分布，但含量較低［6］。漆黃素亦是中藥黃櫨的有效成分［7］，具有抗血管生成［8］、抗腫瘤［9］、緩解骨關(guān)節(jié)炎［10］、對(duì)抗肝細(xì)胞脂肪變性［11］等藥理作用。漆黃素能否緩解膿毒癥誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害尚不明確。本文旨在探究漆黃素可否通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞NOD樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化影響膿毒癥后中樞炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損害，為治療SAE提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6背景的胱天蛋白酶（caspase）-1基因敲除（caspase-1-/-，Cas-1-/-）6周齡雄性小鼠8只，體質(zhì)量18～22 g，用于構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，定義為膿毒癥+caspase-1敲除組（膿毒癥+Cas-1-/-組）。以6周齡野生型雄性C57BL/6小鼠（SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g）作為對(duì)照。按照隨機(jī)數(shù)字表法將野生型小鼠分為3組：假手術(shù)組、膿毒癥組、膿毒癥+漆黃素組，每組26只。所有小鼠購自廣東藥康生物科技有限公司，合格證編號(hào)為44824700016241，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（粵）2022-0136。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)龍南市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：202203）。

1.1.2 主要儀器和試劑 Morris水迷宮（Coulbourn，美國(guó)），垂直電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），熒光顯微鏡（Olympus，日本），總蛋白提取試劑盒（BestBio，中國(guó)），蛋白Marker、Alexa Fluor? 488標(biāo)記的山羊抗鼠熒光二抗、Alexa Fluor? 555標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），兔抗鼠GSDMD蛋白N端片段（GSDMD-N）一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)），兔抗鼠caspase-1、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18、Pink1、Parkin、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅱ、Iba1一抗以及鼠抗鼠β-actin一抗（Abcam，英國(guó)），伊文思藍(lán)、漆黃素（MedChemExpress，美國(guó)），戊巴比妥鈉（Merck，德國(guó)），PVDF膜（Millipore，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥模型制備和漆黃素干預(yù) 本部分小鼠共分4組：假手術(shù)組（26只）、膿毒癥組（26只）、膿毒癥+Cas-1-/-組（8只）和膿毒癥+漆黃素組小鼠（26只）。采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法構(gòu)建膿毒癥小鼠模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉C57BL/6小鼠，腹部剃毛，用碘伏消毒腹部2次?？v向切開腹部皮膚，切口長(zhǎng)1.5～2.0 cm，進(jìn)入腹腔后暴露盲腸并將其分離拉出。結(jié)扎回盲瓣與盲腸末端中點(diǎn)，用21號(hào)針頭穿透結(jié)扎部位后將盲腸重新放回腹腔，最后將腹部切口逐層縫合，碘伏消毒傷口。假手術(shù)組除不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，其他操作同上。在構(gòu)建膿毒癥模型1周前，膿毒癥+漆黃素組小鼠予漆黃素（50 mg/kg）灌胃，連續(xù)7 d。

1.2.2 Morris水迷宮評(píng)估認(rèn)知功能 本部分小鼠共分3組：假手術(shù)組、膿毒癥組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組14只。該裝置由一個(gè)圓形水池、水下圓柱平臺(tái)和固定在水池上方的攝像機(jī)組成，攝像機(jī)用于跟蹤小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。池中充滿水，水溫（25±1）℃，并分成4個(gè)相等的象限。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，讓小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在第2—5天的實(shí)驗(yàn)中，記錄每只小鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間，為逃逸潛伏期。第6天，撤掉平臺(tái)后記錄小鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)腦組織相關(guān)蛋白表達(dá) 本部分小鼠共分4組：假手術(shù)組、膿毒癥組、膿毒癥+Cas-1-/-組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)24 h后取海馬區(qū)腦組織，加入RIPA蛋白裂解緩沖液冰上裂解腦組織。用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后把蛋白裂解液與loading緩沖液混合后，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%牛血清白蛋白封閉后，按照不同蛋白的分子質(zhì)量對(duì)條帶進(jìn)行分割后，分別置于按照1∶1 000稀釋的兔抗鼠Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18一抗，鼠抗鼠β-actin一抗溶液中4 ℃孵育過夜。TBST漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。發(fā)光液敷PVDF膜后，用Fluor Chem 8900軟件分析條帶的信號(hào)強(qiáng)度，自動(dòng)曝光。使用Image J軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行量化。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 本部分小鼠共分4組：假手術(shù)組、膿毒癥組、膿毒癥+Cas-1-/-組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)24 h后，戊巴比妥鈉麻醉后快速處死小鼠，心臟灌注磷酸鹽緩沖液，然后注入4%多聚甲醛以固定組織，立即取出大腦。用4%多聚甲醛外固定，梯度蔗糖脫水，切成4 μm厚的薄片。用1%牛血清白蛋白封閉30 min，4 ℃下孵育Iba1、Pink1、LC3-Ⅱ、caspase-1和IL-1β一抗（稀釋比例1∶100）過夜，然后室溫下孵育Alexa Fluor? 488標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor? 555標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶100）1 h。最后熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 伊文思藍(lán)檢測(cè)血腦屏障（BBB）的通透性 本部分小鼠共分3組：假手術(shù)組、膿毒癥組和膿毒癥+漆黃素組小鼠，每組4只。盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)24 h后經(jīng)小鼠尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)（4 mL/kg），然后戊巴比妥鈉麻醉后快速處死小鼠，先后心臟灌注磷酸鹽緩沖液和4%多聚甲醛，最后取出大腦進(jìn)行拍照。伊文思藍(lán)定量分析：腦組織于60 ℃下加入甲酰胺（1 mL/100 mg）孵育24 h，采用分光光度法在620 nm處測(cè)定伊文思藍(lán)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分布，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漆黃素緩解膿毒癥誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害 與假手術(shù)組相比，膿毒癥組逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，膿毒癥+漆黃素組較膿毒癥組明顯縮短（均P＜0.05），見表1。第6天，假手術(shù)組、膿毒癥組、膿毒癥+漆黃素組穿越平臺(tái)次數(shù)分別為5.4±3.3、1.7±1.5、4.1±1.9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.510，P＜0.01），與假手術(shù)組相比，膿毒癥組明顯減少（P＜0.05），膿毒癥+漆黃素組較膿毒癥組明顯增加（P＜0.05）。

2.2 caspase-1誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá) 與假手術(shù)組相比，膿毒癥組GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；膿毒癥+Cas-1-/-組GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.01），見圖1、表2。與假手術(shù)組比較，膿毒癥組小膠質(zhì)細(xì)胞中caspase-1和IL-1β（紅色熒光）的表達(dá)增加；而caspase-1敲除后，膿毒癥+Cas-1-/-組caspase-1和IL-1β的表達(dá)明顯降低。見圖2。

2.3 漆黃素降低BBB通透性 與假手術(shù)組相比，膿毒癥組腦組織伊文思藍(lán)滲漏增加，而膿毒癥+漆黃素組伊文思藍(lán)滲漏低于膿毒癥組（均P＜0.05），見圖3、表3。與假手術(shù)組相比，膿毒癥組Pink1、Parkin和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯升高，膿毒癥+漆黃素組表達(dá)水平高于膿毒癥組（均P＜0.05）。見圖4、表3。與假手術(shù)組比較，膿毒癥組小膠質(zhì)細(xì)胞中Pink1和LC3-Ⅱ（紅色熒光）的表達(dá)增加，而漆黃素干預(yù)后，膿毒癥+漆黃素組Pink1和LC3-Ⅱ表達(dá)進(jìn)一步增加，見圖5。

前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外［13］。膿毒癥時(shí)，NLRP3炎癥小體的過度激活可引起細(xì)胞焦亡。此時(shí)大量促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞質(zhì)成分被釋放到細(xì)胞外，對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生促炎信號(hào)，使炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致多器官的功能損害［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥后小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體被活化，表現(xiàn)為caspase-l和GSDMD-N表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨炎性因子的釋放，且敲除caspase-l可逆轉(zhuǎn)此過程。可見，小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的中樞炎癥反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要。

膿毒癥后線粒體功能的損害可導(dǎo)致活性氧（ROS）的蓄積，進(jìn)而活化NLRP3炎癥小體，誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致靶器官的損傷。線粒體自噬是選擇性降解受損線粒體的過程，且Pink1/Parkin信號(hào)通路是介導(dǎo)線粒體自噬的經(jīng)典通路［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)漆黃素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化和中樞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為caspase-l、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的下調(diào)。為明確漆黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的機(jī)制，本研究進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)膿毒癥后小膠質(zhì)細(xì)胞通過Pink1/Parkin通路啟動(dòng)了線粒體自噬，從而進(jìn)行損傷線粒體的修復(fù)，而漆黃素進(jìn)一步促進(jìn)了線粒體自噬的進(jìn)程。由此可見，通過促進(jìn)線粒體自噬抑制NLRP3炎癥小體的活化是漆黃素緩解膿毒癥對(duì)BBB和認(rèn)知功能損害的重要干預(yù)靶點(diǎn)。Jia等［18］研究顯示，漆黃素可通過線粒體應(yīng)激依賴性途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的自噬，與本研究結(jié)果基本一致，且本研究明確了漆黃素通過激活線粒體自噬抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的分子機(jī)制。

漆黃素經(jīng)胃腸道吸收后，尚不明確其是否可穿過BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞。因此，不能排除漆黃素首先作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞以降低BBB的通透性，進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的可能性。本研究未檢測(cè)腦組織中漆黃素的含量，有待今后完善。關(guān)于漆黃素與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用關(guān)系是今后研究的方向。

綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化是膿毒癥后中樞炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損害發(fā)生的重要原因。漆黃素可能通過Pink1/Parkin通路促進(jìn)線粒體自噬、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化，進(jìn)而緩解中樞炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損害。本研究為膿毒癥的治療提供了潛在的藥物選擇。

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（2024-05-17收稿 2024-06-11修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（82002074）；江西省衛(wèi)生健康委科技計(jì)劃項(xiàng)目（202312169）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2022506）

作者單位：1龍南市第一人民醫(yī)院急診科（郵編341700）；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）重癥醫(yī)學(xué)科，3急診科

作者簡(jiǎn)介：廖忠（1986），男，副主任醫(yī)師，主要從事膿毒癥相關(guān)臟器損傷的機(jī)制研究。E-mail：liaozhong_ln@163.com