【摘 要】目的：精確定量研究跑步鍛煉對(duì)慢性束縛應(yīng)激（chronic restraint stress，CRS）誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）內(nèi)Sp+興奮性突觸數(shù)量的影響。方法：選取雄性SD大鼠（54只），經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)和糖水基線調(diào)整，在CRS模型建立成功后隨機(jī)分為對(duì)照組、抑郁模型組和模型跑步組，其中模型跑步組大鼠在束縛的第5周開始進(jìn)行為期4周的跑步鍛煉干預(yù)。最后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，并運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代體視學(xué)方法對(duì)各組大鼠mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸變化進(jìn)行精確定量研究。結(jié)果：與對(duì)照組［（97.14±2.64）%］相比，抑郁模型組和模型跑步組大鼠糖精偏好百分比［（89.62±6.05）%］減少（P=0.002），體質(zhì)量的增長減緩，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠的不動(dòng)時(shí)間和新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)的進(jìn)食潛伏期增加。4 周的跑步鍛煉可以有效減緩抑郁模型組大鼠糖精偏好百分比的下降［（89.30±5.06）% vs. （97.30±2.08）%，P=0.018］，降低強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中抑郁大鼠的不動(dòng)時(shí)間，并在新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)中縮短抑郁大鼠的進(jìn)食潛伏期。體視學(xué)精確定量分析結(jié)果顯示，抑郁模型組大鼠mPFC內(nèi)的Sp+興奮性突觸總量［（9.98±0.35）×108個(gè)］低于對(duì)照組［（11.50±1.27）×108個(gè)，P=0.013］。而跑步鍛煉則可以逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠mPFC內(nèi)的Sp+興奮性突觸總數(shù)的減少［模型跑步組（11.30±1.21）×108個(gè)，P=0.003］。結(jié)論：跑步鍛煉干預(yù)后CRS抑郁模型大鼠mPFC的Sp+興奮性突觸數(shù)量的改變可能是跑步鍛煉發(fā)揮抗抑郁作用的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)之一。

【關(guān)鍵詞】跑步鍛煉；抑郁癥；興奮性突觸；內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)；體視學(xué)

【中圖分類號(hào)】R329.4；R749.4+1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-10-07

抑郁癥是一種常見的精神性疾病，不僅嚴(yán)重危害人類健康，而且給家庭和社會(huì)也帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。然而目前針對(duì)抑郁癥的治療藥物仍然存在起效慢，不良反應(yīng)大等很多不足，甚至可能存在增加自殺概率的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，探尋抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，尋找更加安全有效的抗抑郁治療手段，就變得尤為重要。

內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）是抑郁癥受累的主要腦區(qū)[3-4]。既往臨床研究及本團(tuán)隊(duì)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑郁患者及抑郁模型動(dòng)物均存在mPFC 體積的萎縮，提示mPFC結(jié)構(gòu)的改變可能與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[5-6]。而突觸結(jié)構(gòu)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，在多種精神和神經(jīng)疾病中均伴有突觸可塑性異常[7]。Kang HJ等[8]發(fā)現(xiàn)，重度抑郁癥患者大腦中突觸功能相關(guān)基因表達(dá)降低，突觸數(shù)量也相應(yīng)減少。此外，研究者在重度抑郁癥患者以及抑郁模型大鼠的大腦前額葉皮質(zhì)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的下降[9]。這些研究表明，突觸可塑性的改變可能參與了抑郁癥患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連通性下降的過程，進(jìn)而引起抑郁相關(guān)的情緒失調(diào)[10]。另一方面，研究者在復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)過程中廣泛觀察到了興奮性神經(jīng)活動(dòng)和抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)的協(xié)同作用以及興奮/抑制突觸比相對(duì)的恒定[11]。體內(nèi)延時(shí)成像結(jié)果證明，興奮性突觸的丟失對(duì)興奮性神經(jīng)元的樹突發(fā)育和經(jīng)驗(yàn)依賴的神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性有明顯的影響，那么興奮性突觸功能障礙可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路完整性損害，并產(chǎn)生相應(yīng)抑郁行為學(xué)表現(xiàn)[12]。因此，推測(cè)抑郁癥內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)興奮性突觸的變化可能是抑郁癥發(fā)病機(jī)制的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，以往對(duì)抑郁癥大腦突觸變化的研究僅限于突觸相關(guān)蛋白，關(guān)于抑郁癥內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)突觸，特別是興奮性突觸的三維定量研究目前尚未見研究報(bào)道。假設(shè)興奮性突觸改變參與了抑郁癥發(fā)病過程，那么改善內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)興奮性突觸能否出現(xiàn)相應(yīng)的抗抑郁作用目前也并不清楚。

近十年來，越來越多的臨床研究表明，體育鍛煉可以減輕重度抑郁癥的癥狀[13-15]。本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)跑步運(yùn)動(dòng)可以改善慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型大鼠的快感缺乏[16]，然而對(duì)運(yùn)動(dòng)如何改善抑郁癥狀的詮釋仍然不全面。Stranahan AM等[17]指出長期跑步鍛煉可以增加正常大鼠大腦內(nèi)嗅皮質(zhì)內(nèi)突觸密度。另有研究報(bào)道8個(gè)月的跑步鍛煉可減輕TgF344-AD 模型大鼠的抑郁樣行為，并改善TgF344-AD模型大鼠皮質(zhì)樹突棘密度、突觸和突觸前囊泡相對(duì)數(shù)量的減少[18]。上述研究均提示跑步鍛煉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸可能具有保護(hù)作用，可是關(guān)于跑步鍛煉對(duì)抑郁模型動(dòng)物mPFC 內(nèi)突觸的作用，尤其是對(duì)mPFC 興奮性突觸的作用，仍有待研究。突觸后密度蛋白-95（PSD-95）是一種支架蛋白，作為樹突棘中興奮性突觸后密度的豐富成分，將谷氨酸受體聚集在樹突棘中[19]。樹突棘素是一種磷酸酶結(jié)合蛋白，約93%的興奮性突觸被其標(biāo)記[20]。本研究將結(jié)合現(xiàn)代體視學(xué)技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，探討抑郁模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)興奮性突觸數(shù)量的改變，為尋找跑步鍛煉防治抑郁癥的機(jī)制探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性Squrague-Dawley（SD）大鼠6～8周齡，體質(zhì)量（150±10） g，54只，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究符合作者所在單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗樹突棘素單克隆抗體購自于美國Cell SignalingTechnology公司；膠體金（colloidal gold，CG）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購自美國Electron Microscopy Science 公司；體視學(xué)儀器購自丹麥Glostrup公司，大鼠束縛裝置和行為學(xué)測(cè)試裝置均由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 先常規(guī)飼養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境，每籠5～6 只大鼠，其間保證自由進(jìn)食進(jìn)水。正式實(shí)驗(yàn)開始后對(duì)大鼠進(jìn)行糖精基線調(diào)整測(cè)試，在基線調(diào)整期后，將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=22）和應(yīng)激模型組（n=32）。之后對(duì)應(yīng)激模型組進(jìn)行為期4周的慢性束縛應(yīng)激，在應(yīng)激4周末根據(jù)糖精偏好實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將應(yīng)激模型組進(jìn)行隨機(jī)分為抑郁模型組（n=18）和模型跑步組（n=14），且從束縛第5周開始對(duì)模型跑步組大鼠進(jìn)行4周的跑步鍛煉，在應(yīng)激8周末跑步鍛煉結(jié)束。

1.3.2 慢性束縛應(yīng)激模型（chronic restraint stress，CRS）建立 將大鼠置于圓筒狀的束縛裝置中，每日束縛6 h（均在每日9：30～14：30），每周連續(xù)束縛5 d[21]。束縛期間保持禁食禁飲，持續(xù)束縛8周。

1.3.3 跑步鍛煉方案 束縛第5周開始，給予大鼠跑步鍛煉干預(yù)。跑步時(shí)長為20 min/d，每周連續(xù)跑步5 d。第1天跑步速度為10 m/min，之后每天增加2 m/min 直至速度增至20 m/min后恒定跑步速度。

1.3.4 體質(zhì)量測(cè)定 各組大鼠體質(zhì)量在每周日上午固定時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.5.1 糖精偏好實(shí)驗(yàn) 采用糖精偏好實(shí)驗(yàn)（saccharin preferencestest，SPT）對(duì)大鼠的快感缺失程度進(jìn)行評(píng)估[22]。為避免大鼠代謝水平受到影響，本實(shí)驗(yàn)使用糖精替代蔗糖進(jìn)行糖精偏好實(shí)驗(yàn)[23]。給每只大鼠提供相同規(guī)格的1瓶0.03%糖精溶液[24]和純水，瓶子位置隨機(jī)放置，在24 h后分別稱量糖精溶液和純水的重量，計(jì)算大鼠24 h內(nèi)的攝入量。按公式：糖精偏好百分比=攝入糖精溶液量/攝入液體總量×100%，計(jì)算大鼠的糖精偏好。

1.3.5.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimmingtest，F(xiàn)ST）評(píng)估大鼠的行為絕望程度[25]。將大鼠單獨(dú)放置于有水的透明樹脂圓筒（直徑20 cm，高度40 cm）中，水溫為23～25 ℃，水深45 cm，測(cè)試時(shí)間為6 min，計(jì)數(shù)測(cè)試時(shí)間后4 min內(nèi)大鼠在水中的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.5.3 新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn) 采用新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)（novelty suppressed feeding test，NSFT）評(píng)估抗抑郁藥物和跑步鍛煉等的抗抑郁效果[26]。使用邊長50 cm、高40 cm且箱底為黑色的試驗(yàn)箱。箱底中央放置小塊食物于白紙上。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食24 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)從任意的箱角放大鼠入箱內(nèi)，通過攝像系統(tǒng)觀察5 min，記錄大鼠的活動(dòng)量，同時(shí)計(jì)算由放入大鼠到大鼠前肢抱起食物進(jìn)食的時(shí)間。大鼠的活動(dòng)量和進(jìn)食時(shí)間的長短反映了動(dòng)物的抑郁程度，隨后將動(dòng)物放回籠中記錄5 min內(nèi)食物消耗量即后5 min進(jìn)食量，以排除食欲差異對(duì)進(jìn)食時(shí)的影響。

1.3.6 標(biāo)本固定、取材和切片制備 每組隨機(jī)選擇5 只大鼠，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛。剖開大鼠顱骨，取出完整腦組織后浸泡于組織固定液中24 h以上，再放于4 ℃冰箱保存。切片前將固定好的腦組織取出，沿腦裂分為左右半腦，隨機(jī)抽取一側(cè)浸泡于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配置的蔗糖溶液中。按10%、20%、30%濃度梯度進(jìn)行脫水處理。脫水后用冰凍切片機(jī)進(jìn)行50 μm等距離切片，切片按1/6比例進(jìn)行抽樣，每側(cè)半腦可得6組切片。

1.3.7 尼氏染色 為便于后期對(duì)mPFC進(jìn)行分區(qū)，從上述制備的冰凍切片中取每只大鼠第1組的連續(xù)等距切片進(jìn)行尼氏染色。將組織切片在室溫下復(fù)溫30 min，之后將切片貼附于載玻片上，完全晾干后使用免疫組化筆沿切片周圍2～3 mm處畫封閉的線圈。之后將組織切片放入0.01 mol/L的PBS 溶液中浸泡20 min，換用去離子水洗滌5 min，棄去水分。將載玻片正面朝上橫置于濕盒內(nèi)，在組織切片上滴加45 ℃預(yù)熱的尼氏（Nissl）染色液，45 ℃水浴箱內(nèi)孵育40 min，去離子水漂洗2 min后95%乙醇脫色30 s×4次，無水乙醇脫水2 min×2次，二甲苯透明后中性樹脂封片，室溫下晾干。

1.3.8 免疫組織化學(xué)染色 每只動(dòng)物均從6組切片中隨機(jī)抽取1組，依次在0.01 mol/L的PBS和含有0.1%Tween-20的PBS中漂洗3次，每次10 min。之后將切片放于含有10%山羊血清的封閉液中，37 ℃下封閉2 h，之后用封閉液做底液配制兔抗Sp+一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育80 h。充分洗滌后，將切片放于膠體金標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶200），37 ℃下孵育3 h。漂洗后在2%戊二醛中固定10 min，銀增強(qiáng)避光顯色30 min，再次漂洗后貼片風(fēng)干，蘇木素復(fù)染。最后用梯度乙醇逐級(jí)脫水，并用二甲苯透明后中性樹脂封片，室溫下晾干。

1.3.9 體視學(xué)分析 利用體視學(xué)儀器對(duì)各組大鼠mPFC內(nèi)Sp+樹突棘數(shù)目進(jìn)行定量分析。將制備好的切片放置于光學(xué)顯微鏡下，在4×鏡下依據(jù)大鼠腦圖譜利用體視學(xué)分析軟件勾畫出mPFC邊界（圖1A）。大鼠的mPFC主要包括PL、IL和ACC 3個(gè)部分，且3個(gè)部分在組織結(jié)構(gòu)和層次分化上依次向腹側(cè)遷移。由于動(dòng)物存在個(gè)體差異，因此多采用細(xì)胞構(gòu)筑法進(jìn)行mPFC邊界的劃分[6]。mPFC天然缺失第Ⅳ層，分區(qū)時(shí)主要根據(jù)大鼠腦圖譜參照第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ層之間的區(qū)別進(jìn)行劃分[27]。100×油鏡下依據(jù)以下參數(shù)對(duì)Sp+樹突棘進(jìn)行計(jì)數(shù)（圖1B）：切片面積抽樣分?jǐn)?shù)為0.02%，計(jì)數(shù)框面積設(shè)置為4.75 μm2，保護(hù)高度設(shè)置為3 μm，體視框高度為10 μm。按照禁線法則計(jì)數(shù)第一次清晰聚焦于體視框高度內(nèi)的Sp+樹突棘，并根據(jù)光學(xué)分合法公式計(jì)數(shù)大鼠mPFC內(nèi)Sp+樹突棘的總數(shù)目：N = ΣQ- × 1/ssf × 1/asf × 1/hsf，其中ΣQ- 為樣本中實(shí)際計(jì)數(shù)的樹突棘總數(shù)，ssf 為切片抽樣分?jǐn)?shù)，asf 為面積抽樣分?jǐn)?shù)，hsf 為高度抽樣分?jǐn)?shù)。

1.3.10 免疫熒光染色 每只動(dòng)物均從6組切片中隨機(jī)抽取1組，在0.01 mol/L的PBS中漂洗3次，每次10 min，之后在含有0.3%Trinton和0.1%Tween-20的PBS中漂洗6次，每次10min。之后將切片放于枸櫞酸溶液中沸水浴30 min，冷卻后再放入含有0.3%Trinton 和0.1%Tween-20 的PBS 中漂洗3次，之后在含有10%山羊血清的封閉液中，37 ℃下封閉2 h，之后用PBS 做底液配制兔抗PSD-95 一抗（1∶500），4 ℃下孵育48 h。充分洗滌后，將切片放于熒光二抗（DyLight549，1∶200），37 ℃下孵育2 h。漂洗后使用抗熒光猝滅劑封片封片，4 ℃下保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對(duì)體質(zhì)量測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，在正態(tài)性檢驗(yàn)之后進(jìn)行球形度檢驗(yàn)，Plt;0.05進(jìn)行多變量檢驗(yàn)，給出F 值和P 值，若Plt;0.05進(jìn)行兩兩比較，給出具體的P值。其余測(cè)量數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，若數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后仍不符合正態(tài)分布則選用非參數(shù)檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)符合方差齊性采用單因素方差分析，出現(xiàn)Plt;0.05再進(jìn)行LSD多重比較。方差不齊則選用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 跑步鍛煉可以改善抑郁模型大鼠體質(zhì)量增長的緩慢

對(duì)3次體質(zhì)量測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，球形檢驗(yàn)的結(jié)果P=0.001，說明3次測(cè)量的體質(zhì)量間存在高度的相關(guān)性；時(shí)間效應(yīng)（F=1 230.69，P=0.000），交互效應(yīng)（F=11.832，P=0.000）和組間效應(yīng)（F=15.845，P=0.000）的P 值均lt;0.05，說明體質(zhì)量隨時(shí)間不斷增加；且隨時(shí)間改變，分組間體質(zhì)量的增長量不同。跑步鍛煉對(duì)于改善抑郁模型動(dòng)物體質(zhì)量增長的緩慢有一定作用。結(jié)果顯示，應(yīng)激實(shí)驗(yàn)第4周末，與對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量（255.68±23.79） g相比，抑郁模型組（[ 219.56±10.22） g]和模型跑步組（[ 225.98±15.46） g]大鼠的體質(zhì)量增長減緩（F=31.965，P=0.000，圖2）。而在應(yīng)激實(shí)驗(yàn)第8周末時(shí)（F=15.513，P=0.000），模型跑步組大鼠的體質(zhì)量（252.00±16.75） g和抑郁模型組的（240.79±12.03） g相比，增長緩慢得到了改善（F=15.513，P=0.023，圖2）。

2.2 跑步鍛煉可以逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠的抑郁樣行為

2.2.1 跑步鍛煉可以提高抑郁模型大鼠的糖精偏好 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，對(duì)照組（[ 94.80±3.12）%]與應(yīng)激模型組（[ 93.21±4.17）%]大鼠糖精偏好百分比之間的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.476，P=0.639，圖3A）。應(yīng)激第4周時(shí)，應(yīng)激模型組大鼠的糖精偏好百分比低于對(duì)照組[應(yīng)激模型組（89.62±6.05）%vs. 對(duì)照組（97.14±2.64）%，t=3.625，P=0.002，圖3A]；抑郁模型組大鼠糖精偏好仍低于對(duì)照組[抑郁模型組（89.30±5.06）% vs. 對(duì)照組（98.34±1.12）%，F(xiàn)=15.078，P=0.000，圖3B]；模型跑步組大鼠的糖精偏好百分比高于抑郁模型組[模型跑步組（97.30±2.08）% vs.（89.30±5.06）%，F(xiàn)=15.078，P=0.018，圖3B]。

2.2.2 跑步鍛煉可以縮短抑郁模型大鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間 3組大鼠的FST不動(dòng)時(shí)間分別為（4.97±2.19） s、（7.24±6.26） s 和（4.62±2.61） s，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.724，P=0.005），進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠的FST不動(dòng)時(shí)間增加（F=10.724，P=0.040），而與模型跑步組相比大鼠FST 的不動(dòng)時(shí)間縮短（F=10.724，P=0.001，圖4）。

2.2.3 跑步鍛煉可以降低抑郁模型大鼠在新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)食潛伏期 3 組大鼠的進(jìn)食潛伏期分別為（[ 85.53±31.78） s、（234.22±113.02） s和（175.64±63.99） s]，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.443，P=0.000），進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠的FST不動(dòng)時(shí)間增加（F=30.443，P=0.000，圖5A），而與模型跑步組相比大鼠FST的不動(dòng)時(shí)間縮短（F=30.443，P=0.043，圖5A）。而各組大鼠后5 min進(jìn)食量分別為（[ 1.99±0.51） g、（1.54±0.39） g和（1.36±0.58） g]，3組比較并無明顯差異（F=1.544，P=0.225，圖5B）。

2.3 跑步鍛煉可以逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠的mPFC內(nèi)興奮性突觸密度的減少

各組大鼠mPFC內(nèi)PSD-95免疫熒光代表性圖片見圖6，可見抑郁模型大鼠mPFC內(nèi)PSD-95的密度低于對(duì)照組和模型跑步組。

2.4 跑步鍛煉可以逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠的mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸密度和總數(shù)目的降低

各組大鼠mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸免疫組化染色的代表性圖片如圖7A所示，大鼠Sp+興奮性突觸體視學(xué)參數(shù)見表1。體視學(xué)結(jié)果顯示：抑郁模型組（[ 0.135±0.013）個(gè)/μm3]大鼠Sp+突觸密度低于對(duì)照組（[ 0.139±0.011）個(gè)/μm3]和模型跑步組（[ 0.145±0.009）個(gè)/μm3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.856，P=0.097），見圖7B。3組大鼠mPFC內(nèi)Sp+突觸數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.340，P=0.025），其中抑郁模型組大鼠mPFC內(nèi)Sp+突觸數(shù)量（[ 9.98±0.35）×108個(gè)]低于對(duì)照組（[ 11.50±1.27）×108個(gè)，P=0.013，圖7C]，模型跑步組（[ 11.30±1.21）×108 個(gè)]mPFC 內(nèi)Sp+突觸數(shù)量高于抑郁模型組（P=0.003，圖7C）。可見觀察到的體視學(xué)抽樣變異的觀察誤差系數(shù)（observedcoefficient of error，OCE）lt;0.15，動(dòng)物內(nèi)變異系數(shù)（observedcoefficient of variation，OCV）lt;0.15，且個(gè)體估計(jì)值的觀察方差（OCE2）遠(yuǎn)小于觀察個(gè)體間方差（OCV2）的50%（表1），本研究中的體視學(xué)抽樣符合標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

本研究選擇慢性束縛應(yīng)激作為抑郁動(dòng)物模型，CRS模型具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)，并且能誘導(dǎo)穩(wěn)定的抑郁樣行為等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于抑郁癥中研究動(dòng)物大腦各腦區(qū)結(jié)構(gòu)的變化、細(xì)胞和分子機(jī)制等的改變[28-30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4周的慢性束縛應(yīng)激后大鼠表現(xiàn)出體質(zhì)量增長減緩，糖精偏好百分比降低，強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間延長，新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)中進(jìn)食潛伏期延長，提示CRS模型大鼠已表現(xiàn)出快感缺失、行為絕望等抑郁樣行為，模型建立成功。而4周跑步鍛煉治療可以有效延緩慢性應(yīng)激誘發(fā)的大鼠體質(zhì)量增長的緩慢，有效改善了抑郁模型大鼠的快感缺失、行為絕望等抑郁樣行為，這一行為學(xué)結(jié)果與既往跑步鍛煉改善抑郁的研究結(jié)果[31-32]，以及本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果相一致[33-34]，也進(jìn)一步證明了跑步鍛煉可能是改善抑郁癥狀和抑郁行為的有效治療手段。

作為調(diào)控學(xué)習(xí)記憶和情緒反應(yīng)的重要腦區(qū)，mPFC 與包括抑郁癥在內(nèi)的多種精神疾病有關(guān)[3]。既往研究顯示抑郁癥可能與mPFC內(nèi)突觸可塑性的改變有關(guān)[35]。而在慢性束縛應(yīng)激可以引起大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元頂端樹突棘消退[36-37]。LiCC等[38]采用高爾基染色、透射電鏡技術(shù)和熒光雙標(biāo)共定位的方式半定量研究內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)的突觸發(fā)現(xiàn)，在慢性溫和應(yīng)激模型大鼠mPFC內(nèi)存在突觸數(shù)量的相對(duì)減少。本實(shí)驗(yàn)采用樹突棘素對(duì)mPFC內(nèi)興奮性突觸樹突棘頂端進(jìn)行免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行染色標(biāo)記并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示4周慢性束縛應(yīng)激降低了抑郁模型組大鼠大腦mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸密度，提示抑郁癥mPFC可能存在Sp+興奮性突觸的丟失。這一結(jié)果與既往抑郁癥mPFC突觸改變的結(jié)論相一致，而這些研究只采用定性和半定量方法對(duì)突觸進(jìn)行研究，關(guān)于抑郁癥內(nèi)側(cè)前額葉內(nèi)興奮性突觸數(shù)量的精確定量研究仍未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步運(yùn)用新的無偏體視學(xué)方法對(duì)各組大鼠mPFC內(nèi)興奮性Sp+興奮性突觸的數(shù)量進(jìn)行了精確定量。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型組大鼠大腦mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸數(shù)量為9.98×108，相較于對(duì)照組大鼠mPFC 內(nèi)Sp+興奮性突觸數(shù)量（11.5×108）降低了13.22%。這表明慢性束縛應(yīng)激介導(dǎo)的抑郁樣行為可能與大鼠mPFC內(nèi)的興奮性突觸的丟失有關(guān)，mPFC突觸可塑性，特別是mPFC內(nèi)興奮性突觸的可塑性降低可能是抑郁癥發(fā)病的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

值得注意的是，突觸的可塑性改變可能不僅參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，也可能與抗抑郁機(jī)制密切相關(guān)[8，39]。那么有效提升突觸可塑性是否可能達(dá)到改善抑郁癥狀的效果，目前并不明確。作為簡(jiǎn)單有效的行為學(xué)干預(yù)手段，跑步鍛煉可以有效改善患者的抑郁情緒[4]。但跑步鍛煉的具體抗抑郁機(jī)制目前并不完全清楚。以往研究表明，跑步鍛煉可以增加mPFC的體積，增強(qiáng)mPFC內(nèi)神經(jīng)元活動(dòng)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，大腦動(dòng)脈閉塞模型小鼠在跑步鍛煉后缺血區(qū)域出現(xiàn)樹突棘密度增加，突觸可塑性增強(qiáng)[40]；正常大鼠在長期跑步鍛煉后也出現(xiàn)海馬和內(nèi)嗅皮層內(nèi)樹突棘形態(tài)的改變和突觸密度的增加[17]；而在慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，3周的跑步鍛煉可以改善大鼠抑郁樣行為的同時(shí)，也改善了mPFC錐體神經(jīng)元棘突密度的降低和棘突形態(tài)的改變[41]。上述結(jié)果提示跑步鍛煉可能對(duì)抑郁大腦突觸具有保護(hù)作用。本研究對(duì)mPFC內(nèi)興奮性突觸的研究結(jié)果也顯示，在4周跑步鍛煉后，相較于抑郁模型組，模型跑步組大鼠mPFC內(nèi)PSD-95的密度低于抑郁模型組，模型跑步組的大鼠大腦mPFC內(nèi)的Sp+興奮性突觸密度也出現(xiàn)明顯提高，提示跑步鍛煉可能對(duì)抑郁癥Sp+興奮性突觸具有保護(hù)作用。這些結(jié)果與既往跑步鍛煉保護(hù)mPFC內(nèi)突觸的研究結(jié)論相一致。之后進(jìn)一步對(duì)跑步鍛煉后的CRS抑郁模型大鼠mPFC內(nèi)的興奮性突觸的數(shù)量進(jìn)行精確定量研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4周的跑步鍛煉后，CRS抑郁模型組大鼠mPFC 內(nèi)的樹突棘數(shù)量為11.3×108，高于CRS抑郁模型組大鼠（9.98×108），這提示跑步鍛煉改善模型大鼠抑郁樣行為可能與mPFC內(nèi)興奮性Sp+突觸數(shù)量的恢復(fù)有關(guān)。可以猜測(cè)，跑步鍛煉可能通過增加mPFC內(nèi)Sp+興奮性突觸數(shù)量，保護(hù)mPFC的突觸可塑性，實(shí)現(xiàn)了抗抑郁效果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示CRS模型大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為和mPFC內(nèi)的Sp+興奮性突觸數(shù)量減少，而跑步鍛煉可改善這種改變。目前主要聚焦在mPFC內(nèi)總的興奮性突觸的精確定量研究，關(guān)于跑步鍛煉對(duì)抑郁癥mPFC內(nèi)各亞區(qū)興奮性突觸的影響及其可能的分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步說明了跑步鍛煉可能通過有效保護(hù)抑郁模型大鼠mPFC內(nèi)興奮性突觸的數(shù)量改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，這可能是跑步鍛煉抗抑郁的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步闡明跑步鍛煉抗抑郁機(jī)制提供了可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Smith K. Mental health：a world of depression[J]. Nature，2014，515

（7526）：181．

[2] Ménard C，Hodes GE，Russo SJ. Pathogenesis of depression：insights

from human and rodent studies[J]. Neuroscience，2016，321：138-

162．

[3] Klune CB，Jin B，DeNardo LA. Linking mPFC circuit maturation to

the developmental regulation of emotional memory and cognitive flexibility

[J]. Elife，2021，10：e64567．

[4] McEwen BS. Physiology and neurobiology of stress and adaptation：

central role of the brain[J]. Physiol Rev，2007，87（3）：873-904．

[5] Salvadore G，Nugent AC，Lemaitre H，et al. Prefrontal cortical

abnormalities in currently depressed versus currently remitted patients

with major depressive disorder[J]. Neuroimage，2011，54（4）：2643-2651.

[6] Luo YM，Xiao Q，Wang J，et al. Running exercise protects oligodendrocytes

in the medial prefrontal cortex in chronic unpredictable

stress rat model[J]. Transl Psychiatry，2019，9（1）：322．

[7] Verpelli C，Montani C，Vicidomini C，et al. Mutations of the synapse

genes and intellectual disability syndromes[J]. Eur J Pharmacol，

2013，719（1/2/3）：112-116．

[8] Kang HJ，Voleti B，Hajszan T，et al. Decreased expression of

synapse-related genes and loss of synapses in major depressive disorder

[J]. Nat Med，2012，18（9）：1413-1417．

[9] Feyissa AM，Chandran A，Stockmeier CA，et al. Reduced levels of

NR2A and NR2B subunits of NMDA receptor and PSD-95 in the prefrontal

cortex in major depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol

Psychiatry，2009，33（1）：70-75．

[10] Duman RS. Neurobiology of stress，depression，and rapid acting

antidepressants：remodeling synaptic connections[J]. Depress Anxiety，

2014，31（4）：291-296．

[11] He HY，Shen WH，Zheng LJ，et al. Excitatory synaptic dysfunction

cell-autonomously decreases inhibitory inputs and disrupts structural

and functional plasticity[J]. Nat Commun，2018，9（1）：2893．

[12] Froemke RC. Plasticity of cortical excitatory-inhibitory balance

[J]. Annu Rev Neurosci，2015，38：195-219．

[13] Dimeo F，Bauer M，Varahram I，et al. Benefits from aerobic exercise

in patients with major depression：a pilot study[J]. Br J Sports Med，

2001，35（2）：114-117．

[14] Dunn AL，Trivedi MH，Kampert JB，et al. Exercise treatment for

depression：efficacy and dose response[J]. Am J Prev Med，2005，28（1）：

1-8．

[15] Mather AS，Rodriguez C，Guthrie MF，et al. Effects of exercise on

depressive symptoms in older adults with poorly responsive depressive

disorder：randomised controlled trial[J]. Br J Psychiatry，2002，180：411-

415．

[16] Chen LM，Zhang AP，Wang FF，et al. Running exercise protects

the capillaries in white matter in a rat model of depression[J]. J Comp

Neurol，2016，524（17）：3577-3586．

[17] Stranahan AM，Khalil D，Gould E. Running induces widespread

structural alterations in the hippocampus and entorhinal cortex[J]. Hippocampus，

2007，17（11）：1017-1022．

[18] Yang LD，Wu CY，Li Y，et al. Long-term exercise pre-training

attenuates Alzheimer's disease-related pathology in a transgenic rat

model of Alzheimer's disease[J]. Geroscience，2022，44（3）：1457-1477．

[19] Coley AA，Gao WJ. PSD95：a synaptic protein implicated in

schizophrenia or autism？[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，

2018，82：187-194．

[20] Hao JD，Janssen WGM，Tang Y，et al. Estrogen increases the

number of spinophilin-immunoreactive spines in the hippocampus of

young and aged female rhesus monkeys[J]. J Comp Neurol，2003，465

（4）：540-550．

[21] Chiba，Numakawa T，Ninomiya M，et al. Chronic restraint stress

causes anxiety- and depression-like behaviors，downregulates glucocorticoid

receptor expression，and attenuates glutamate release induced by

brain-derived neurotrophic factor in the prefrontal cortex[J]. Prog Neuropsychopharmacol

Biol Psychiatry，2012，39（1）：112-119．

[22] Liu MY，Yin CY，Zhu LJ，et al. Sucrose preference test for measurement

of stress-induced anhedonia in mice[J]. Nat Protoc，2018，13

（7）：1686-1698．

[23] Magnuson BA，Carakostas MC，Moore NH，et al. Biological fate of

low-calorie sweeteners[J]. Nutr Rev，2016，74（11）：670-689．

[24] Gebara E，Zanoletti O，Ghosal S，et al. Mitofusin-2 in the nucleus

accumbens regulates anxiety and depression-like behaviors through mitochondrial

and neuronal actions[J]. Biol Psychiatry，2021，89（11）：

1033-1044．

[25] Hu CL，Luo Y，Wang H，et al. Re-evaluation of the interrelationships

among the behavioral tests in rats exposed to chronic unpredictable

mild stress[J]. PLoS One，2017，12（9）：e0185129．

[26] Ramaker MJ，Dulawa SC. Identifying fast-onset antidepressants

using rodent models[J]. Mol Psychiatry，2017，22（5）：656-665．

[27] Cerqueira JJ，Pêgo JM，Taipa R，et al. Morphological correlates of

corticosteroid-induced changes in prefrontal cortex-dependent behaviors[

J]. J Neurosci，2005，25（34）：7792-7800．

[28] Zhang JY，Liu TH，He Y，et al. Chronic stress remodels synapses

in an amygdala circuit-specific manner[J]. Biol Psychiatry，2019，85

（3）：189-201．

[29] Tse YC，Nath M，Larosa A，et al. Opposing changes in synaptic

and extrasynaptic N-methyl-D-aspartate receptor function in response

to acute and chronic restraint stress[J]. Front Mol Neurosci，2021，14：

716675．

[30] Yi JH，Jeon J，Kwon H，et al. Rubrofusarin attenuates chronic

restraint stress-induced depressive symptoms[J]. Int J Mol Sci，2020，21

（10）：3454．

[31] Bj?rnebekk A，Mathé AA，Brené S. Running has differential effects

on NPY，opiates，and cell proliferation in an animal model of depression

and controls[J]. Neuropsychopharmacology，2006，31（2）：256-

264．

[32] Greenwood BN，F(xiàn)oley TE，Day HE，et al. Freewheel running prevents

learned helplessness/behavioral depression：role of dorsal raphe

serotonergic neurons[J]. J Neurosci，2003，23（7）：2889-2898．

[33] Xiao K，Luo YM，Liang X，et al. Beneficial effects of running exercise

on hippocampal microglia and neuroinflammation in chronic unpredictable

stress-induced depression model rats[J]. Transl Psychiatry，

2021，11（1）：461．

[34] Tang J，Liang X，Dou XY，et al. Exercise rather than fluoxetine

promotes oligodendrocyte differentiation and myelination in the hippocampus

in a male mouse model of depression[J]. Transl Psychiatry，

2021，11（1）：622．

[35] Price RB，Duman R. Neuroplasticity in cognitive and psychological

mechanisms of depression：an integrative model[J]. Mol Psychiatry，

2020，25（3）：530-543．

[36] Radley JJ，Sisti HM，Hao J，et al. Chronic behavioral stress induces

apical dendritic reorganization in pyramidal neurons of the medial

prefrontal cortex[J]. Neuroscience，2004，125（1）：1-6．

[37] Shansky RM，Morrison JH. Stress-induced dendritic remodeling

in the medial prefrontal cortex：effects of circuit，hormones and rest[J].

Brain Res，2009，1293：108-113．

[38] Li CC，Liu B，Xu JY，et al. Phloretin decreases microgliamediated

synaptic engulfment to prevent chronic mild stress-induced

depression-like behaviors in the mPFC[J]. Theranostics，2023，13（3）：

955-972．

[39] Li WF，Ali T，He KW，et al. Ibrutinib alleviates LPS-induced

neuroinflammation and synaptic defects in a mouse model of depression

[J]. Brain Behav Immun，2021，92：10-24．

[40] Shen WM，Jin LQ，Zhu AQ，et al. Treadmill exercise enhances

synaptic plasticity in the ischemic penumbra of MCAO mice by inducing

the expression of Camk2a via CYFIP1 upregulation[J]. Life Sci，

2021，270：119033．

[41] Zhuang PC，Tan ZN，Jia ZY，et al. Treadmill exercise reverses depression

model-induced alteration of dendritic spines in the brain areas

of mood circuit[J]. Front Behav Neurosci，2019，13：93．

（責(zé)任編輯：曾 玲）