摘要為了進一步研究黃鱔（Monopterusalbus）雄激素受體的結(jié)構(gòu)與功能，利用生物信息學(xué)方法對黃鱔雄激素受體的理化性質(zhì)與空間結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測。結(jié)果表明，黃鱔雄激素受體基因全長2774bp，完整開放閱讀框2238bp，可以編碼746個氨基酸。M.albusAR蛋白的分子量為83.71ku，為酸性親水的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，不具有信號肽和跨膜區(qū)域，不屬于分泌蛋白。該蛋白有72個可能的磷酸化位點。該蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

關(guān)鍵詞黃鱔；雄激素受體；生物信息學(xué)分析

中圖分類號S966.4"文獻標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0080-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

BioinformaticsAnalysisofAndrogenReceptorinMonopterusalbus

LING Zhi1， YANG Wen-lin1， YUAN Han-wen^1，2

（1.YangtzeUniversity，Jingzhou，Hubei434025;2.HubeiProvinceMonopterusalbusTechnologyResearchCenter，Jingzhou，Hubei"434025）

AbstractInordertofurtherstudythestructureandfunctionoftheandrogenreceptorintheeel（Monopterusalbus），"bioinformaticsmethodswereusedtopredictthephysicochemicalpropertiesandspatialstructureofM.albusAR.TheresultsshowedthatM.albusARgenehadatotallengthof2774bp，acompleteopenreadingframeof2238bp，anditcouldencode746aminoacids."ThemolecularweightofM.albusARproteinwas83.71ku，itwasanacidicandhydrophilicunstableprotein.Ithadnosignalpeptidesortransmembraneregionsanditwasnotasecretedprotein.Thisproteinhad72possiblephosphorylationsites.Thesecondstructureofthisproteinwasmainlyα-helixandrandomcoil.

KeywordsMonopterusalbus;Androgenreceptors;Bioinformaticsanalysis

雄激素受體（androgen receptor，AR）是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子^［1］，它的幾個關(guān)鍵功能（如激素識別和輔調(diào)節(jié)因子等），都集中在配體結(jié)合域（LBD）中^［2］。AR是類固醇受體的一種，通過招募輔激活子啟動其靶基因的轉(zhuǎn)錄來激活基因轉(zhuǎn)錄。與其他類固醇受體相比，AR的激活功能在很大程度上依賴位于其N端結(jié)構(gòu)域（NTD）的配體，AR二聚反應(yīng)遵循獨特的頭對頭和尾對尾方式，AR NTD是輔激活因子招募的主要場所^［3］。雄激素受體基因突變是人類（Homo sapiens）性發(fā)育障礙（DSD）的主要原因之一，表現(xiàn)為性模糊或性逆轉(zhuǎn)^［4］。鱖魚（Siniperca chuatsi）甲基睪酮（MT）誘導(dǎo)的雌雄性逆轉(zhuǎn)過程中，MT處理30和35 d后ARβ的表達顯著上調(diào)，提示ARβ可能在精子發(fā)生和雄性化過程中起關(guān)鍵作用。鱖魚中分離到AR cDNA全長，在雌、雄魚性腺和肝臟中均有高表達；在性別分化早期，雌魚AR的表達在孵化后5～30 d均高于雄魚，30 d 時達到高峰^［5］。金錢魚（Scatophagus argus）雄激素通過刺激AR表達、抑制雌性發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因表達，從而影響卵巢發(fā)育^［6］。在MT誘導(dǎo)石斑魚（Epinephelus coioides）的性反轉(zhuǎn)過程中，下丘腦和性腺中AR的表達模式表明AR參與調(diào)節(jié)這一過程^［7］。

黃鱔（Monopterus albus）是一個具有性別反轉(zhuǎn)特征的原始脊椎動物，黃鱔AR蛋白的羧基端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的第553～588位氨基酸序列對睪丸素的結(jié)合很重要，它們的存在對羧基端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是否能形成正確的空間構(gòu)象非常關(guān)鍵。黃鱔AR基因的表達水平在雄性性腺、脾臟和肝臟中較高，而在腦和雌性性腺中的表達量低于其他部位，而且隨著黃鱔性腺逐步由雌性性腺向雄性性腺轉(zhuǎn)變，黃鱔AR基因的表達量逐漸上升^［8］。黃鱔AR不同于人類的AR，尤其是在配體結(jié)合域（LBD）中，其在性腺中的表達量由卵巢經(jīng)卵睪向精巢的轉(zhuǎn)化過程中呈增加趨勢，且在DNA結(jié)合域和鉸鏈區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個功能核定位信號^［9］。

AR在生物體中起到至關(guān)重要的作用，目前AR在其他生物體中的研究較多，在黃鱔中也有部分研究。筆者以黃鱔AR基因為研究對象，利用生物信息學(xué)的方法對其理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、疏水性、信號肽、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測分析，并與人類、鱖魚、金錢魚、石斑魚的AR結(jié)構(gòu)進行對比，旨在為進一步研究M.albusAR基因的功能提供一定參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

在NCBI網(wǎng)站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中查詢，得到黃鱔AR的氨基酸序列（XP_020454405.1）、人類AR氨基酸序列（NP_000035.2）、鱖魚AR氨基酸序列（XP_044060142.1）、金錢魚AR氨基酸序列（XP_046266164.1）、石斑魚AR氨基酸序列（ADQ43815.1）。

1.2試驗方法

生物信息學(xué)分析工具如表1所示。利用表1中分析工具對黃鱔、人類、鱖魚、金錢魚、石斑魚進行AR氨基酸序列比對，對其理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、磷酸化位點、無序化特征、二級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1AR蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線軟件對5種生物的AR進行理化性質(zhì)分析（表2），結(jié)果表明黃鱔

AR基因全長2774bp，開放閱讀框長2238bp，編碼合成746個氨基酸；蛋白分子量（MW）為83.71ku，推斷它為帶有負(fù)電的、不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，黃鱔AR蛋白總原子數(shù)為11600個，分子式為C3672H5740N1022O1113S53。人類AR基因的開放閱讀框長2760bp，編碼合成920個氨基酸，蛋白分子量（MW）為99.19ku，為帶有負(fù)電的、不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，蛋白總原子數(shù)為13730個，分子式為C4342H6772N1220O1347S49。鱖魚AR基因的開放閱讀框長1950bp，編碼合成650個氨基酸，蛋白分子量（MW）為72.29ku，為帶有正電的、不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，蛋白總原子數(shù)為10022個，分子式為C3131H4973N907O962S49。金錢魚AR基因的開放閱讀框長2437bp，編碼合成768個氨基酸，蛋白分子量（MW）為86.66ku，為帶有負(fù)電的、不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，蛋白總原子數(shù)為11992個，分子式為C3811H5914N1064O1155S48。石斑魚AR基因的開放閱讀框長2350bp，編碼合成759個氨基酸，蛋白分子量（MW）為84.70ku，為帶有負(fù)電的、不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，蛋白總原子數(shù)為11674個，分子式為C3704H5751N1021O1139S59。

在這5種生物中AR蛋白理論等電點（PI）均低于7，均屬于酸性蛋白質(zhì)。5種生物中，含量較高的氨基酸均為Leu，占8.3％～10.0％；含量較低的氨基酸均為Trp，占0.9％～1.1％，均不含Pyl和Sec，而Leu、Ser和Ala是這幾種生物AR所共有的主要氨基酸。不穩(wěn)定系數(shù)均高于40的閾值，說明此蛋白在這5種物種中均為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄杷跃鶠樨?fù)值，這5種生物AR蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)。

2.2AR蛋白的跨膜區(qū)、信號肽分析

利用TMHMM2.0在線軟件預(yù)測這5種生物的AR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該5種生物均不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖1）。

利用SignalP5.0在線軟件預(yù)測這5種生物AR蛋白的信號肽，結(jié)果表明均不存在信號肽（圖2），推測該蛋白不屬于分泌蛋白，或者帶有信號肽的前體蛋白到運輸部位跨膜后信號肽已被切除，并未折疊為成熟的蛋白質(zhì)。

2.3AR蛋白的親水性、疏水性分析

用DNAMan6.0軟件預(yù)測這5種生物AR蛋白的氨基酸疏水性位點及分值（圖3）。K-D標(biāo)度用于評估氨基酸的疏水性，若大于0表示疏水性，若小于0表示親水性。這5種生物AR各氨基酸分值多為負(fù)值，因此這5種生物AR蛋白均為親水性蛋白。

氨基酸的親水性、疏水性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理功能具有重要的作用。親水性和疏水性氨基酸可以預(yù)測跨膜蛋白的位置，構(gòu)成疏水的二級結(jié)構(gòu)，便于蛋白質(zhì)跨膜、形成更高級的結(jié)構(gòu)，同時疏水氨基酸的疏水基團還可促進蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的折疊^［10］。

2.4AR蛋白的無序化特征分析

蛋白質(zhì)固有無序化特征是反映蛋白質(zhì)功能的一個重要指標(biāo)。該研究利用NovoPro程序?qū)R蛋白進行了折疊無序化分析（圖4），發(fā)現(xiàn)M.albusAR氨基酸序列存在9個無序化區(qū)域，最長無序化區(qū)域由55個氨基酸組成，共有282個無序化氨基酸；人類AR氨基酸序列存在7個無序化區(qū)域，最長無序化區(qū)域由106個氨基酸組成，共有253個無序化氨基酸；鱖魚AR氨基酸序列存在6個無序化區(qū)域，最長的無序化區(qū)域由78個氨基酸組成，共有168個無序化氨基酸；金錢魚AR氨基酸序列存在8個無序化區(qū)域，最長的無序化區(qū)域由170個氨基酸組成，共有356個無序化氨基酸；石斑魚AR氨基酸序列存在11個無序化區(qū)域，最長的無序化區(qū)域由74個氨基酸組成，共有275個無序化氨基酸。上述結(jié)果顯示M.albusAR的無序化特征與其他4種生物的AR無序化特征差異較大，因此M.albusAR所執(zhí)行的功能可能與其他4種生物AR所執(zhí)行的功能有所不同，為進一步研究M.albusAR無序化區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系提供了依據(jù)。

2.5AR蛋白的磷酸化位點分析

磷酸化多數(shù)情況下發(fā)生在絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、蘇氨酸（Thr）等氨基酸的殘基上。在NetPhos3.1上進行磷酸化位點預(yù)測（圖5），發(fā)現(xiàn)M.albusAR的絲氨酸（Ser）磷酸化位點有42個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點有7個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點有23個；人類AR的絲氨酸（Ser）磷酸化位點有45個，絡(luò)氨酸磷酸化位點有10個，蘇氨酸磷酸化位點有17個；鱖魚AR的絲氨酸（Ser）磷酸化位點有36個，絡(luò)氨酸（Tyr）磷酸化位點有4個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點有17個；金錢魚AR的絲氨酸（Ser）磷酸化位點有41個，絡(luò)氨酸（Tyr）磷酸化位點有8個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點有21個；石斑魚AR的絲氨酸（Ser）磷酸化位點有37個，絡(luò)氨酸（Tyr）磷酸化位點有10個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點有22個。以上結(jié)果表明，這5種生物的AR蛋白能夠被激酶磷酸化，進而實現(xiàn)AR蛋白的功能調(diào)控。

2.6AR蛋白的二級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA軟件進行5種生物AR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測（圖6），結(jié)果表明M.albusAR蛋白中的α-螺旋有244個氨基酸，占總量的32.71％；β-折疊有36個氨基酸，占4.82％；無規(guī)則卷曲有394個氨基酸，占52.82％；延伸鏈有72個氨基酸，占9.65％。人類AR蛋白中的α-螺旋有311個氨基酸，占總量的33.80％；β-折疊有68個氨基酸，占7.39％；無規(guī)則卷曲有445個氨基酸，占48.37％；延伸鏈有96個氨基酸，占10.44％。鱖魚AR蛋白中的α-螺旋有234個氨基酸，占總量的36.00％；β-折疊有30個氨基酸，占4.61％；無規(guī)則卷曲有306個氨基酸，占47.08％；延伸鏈有80個氨基酸，占12.31％。金錢魚AR蛋白中的α-螺旋有258個氨基酸，占總量的33.59％；β-折疊有33個氨基酸，占4.30％；無規(guī)則卷曲有401個氨基酸，占52.21％；延伸鏈有76個氨基酸，占9.90％。石斑魚AR蛋白中的α-螺旋有257個氨基酸，占總量的33.86％；β-折疊有29個氨基酸，占3.82％；無規(guī)則卷曲有387個氨基酸，占50.99％；延伸鏈有86個氨基酸，占11.33％。

5種生物AR蛋白中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈所占比重較大，都不含有310螺旋、π螺旋、β-橋、彎曲區(qū)、模糊狀態(tài)以及其他狀態(tài)，由此可見α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)沁@5種生物AR蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件。

2.7AR氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將5種生物的AR氨基酸序列用Mega5軟件進行比對分析（圖7），再采用N-J方法進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可以發(fā)現(xiàn)這5種生物的親緣關(guān)系存在明顯差異，其中黃鱔M.albusAR與金錢魚、石斑魚的AR的進化關(guān)系更近。

3結(jié)論與討論

雄激素受體在許多物種中均有相關(guān)研究，其基因特征在不同物種中存在細微差異，但總體來說差異不大，比如在黃鱔、人類、鱖魚、金錢魚和石斑魚中均是帶有負(fù)電的、不穩(wěn)定的親水酸性蛋白質(zhì)，均沒有信號肽和跨膜區(qū)，二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主。由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有密切關(guān)系，AR在人類、鱖魚、金錢魚和石斑魚中均與性逆轉(zhuǎn)有關(guān)^［4-7］，故而推測其與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)也有關(guān)。

參考文獻

［1］PANGJP，SHENC，ZHOUWF，etal.DiscoveryofnovelantagoniststargetingtheDNAbindingdomainofandrogenreceptorbyintegrateddocking-basedvirtualscreeningandbioassays［J］.Actapharmacologicasinica，2022，43（1）：229-239.

［2］HELSENC，NGUYENT，VERCRUYSSET，etal.TheT850Dphosphomimeticmutationintheandrogenreceptorligandbindingdomainenhancesrecruitmentatactivationfunction2［J］.Internationaljournalofmolecularsciences，2022，23（3）：1-12.

［3］YUXZ，YIP，HAMILTONRA，etal.Structuralinsightsoftranscriptionallyactive，full-lengthandrogenreceptorcoactivatorcomplexes［J］.Molecularcell，2020，79（5）：812-823.

［4］SHOJAEIA，BEHJATIF，EBRAHIMZADEH-VESALR，etal.Mutationanalysisofandrogenreceptorgene：Multipleusesforasingletest［J］.Gene，2014，552（2）：234-238.

［5］OUYANGHF，HANC，ZHUQY，etal.MolecularcloningandcharacterizationofestrogenandandrogenreceptorsinMandarinfish，Sinipercachuatsi［J］.Aquaculturereports，2021，21：1-12.

［6］戴明莉.金錢魚雄激素受體的克隆及其表達模式的研究［D］.湛江：廣東海洋大學(xué)，2015.

［7］SHIY，LIUXC，ZHANGHF，etal.MolecularidentificationofanandrogenreceptoranditschangesinmRNAlevelsduring17α-methyltestosterone-inducedsexreversalintheorange-spottedgrouperEpinepheluscoioides［J］.Comparativebiochemistryandphysiology，partB，2012，163（1）：43-50.

［8］ZHOUF，ZHAOW，ZUOZX，etal.Characterizationofandrogenreceptorstructureandnucleocytoplasmicshuttlingofthericefieldeel［J］.Thejournalofbiologicalchemistry，2010，285（47）：37030-37040.

［9］周芳.黃鱔AR基因的克隆、表達及其蛋白的核質(zhì)穿梭［D］.武漢：武漢大學(xué)，2010.

［10］李吉.膜蛋白跨膜螺旋預(yù)測的研究［D］.上海：上海交通大學(xué)，2010.