摘要：通過同時蒸餾萃取法去除4種進口煙葉中的揮發(fā)性成分，獲得煙葉水提物，采用β-葡萄糖苷酶水解煙葉水提物中糖苷鍵合態(tài)成分，制備鍵合態(tài)香氣化合物，利用氣相色譜-質譜法（GC-MS）分析鍵合態(tài)香氣化合物的組成，以揭示4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物的差異。結果表明：（1）津巴布韋、加拿大、美國、巴西煙葉中分別鑒定出鍵合態(tài)香氣化合物30、31、32、26種，含量分別為1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL；（2）主成分和層次聚類分析表明，4種進口煙葉中鍵合態(tài)化合物成分含量存在較大差異；（3）通過OPLS-DA對不同煙葉中鍵合態(tài)化合物含量進行分析，從4種進口煙葉中共篩選出18種含量具有顯著差異的鍵合態(tài)香氣化合物，其中，津巴布韋煙葉中有5種，加拿大煙葉有5種，美國煙葉中有5種，巴西煙葉中有3種。結論可知，進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物的含量存在明顯差異，OPLS-DA法能以該類成分的含量有效區(qū)分4種進口煙葉，該方法可以用于4種進口煙葉的產地溯源。

關鍵詞：煙葉；β-葡萄糖苷酶；酶解；鍵合態(tài)；香氣化合物

中圖分類號：TS41⁺1""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0209-06

作為中式卷煙的重要功能原料，優(yōu)質進口煙葉在我國高檔卷煙葉組配方中的使用比例不斷增加，僅巴西一國的年度采購量就已經接近國內收購計劃的4%左右^［1］。除巴西以外，我國還從津巴布韋、美國和加拿大等煙葉生產國進口大量優(yōu)質煙葉。但隨著國際形勢和政策的不斷變化，優(yōu)質煙葉的進口從數量和質量上均受到較大制約，嚴重影響了我國重點品牌卷煙風格特征和產品質量的維護工作^［2-3］。因此，中國煙草總公司近年來開展了一系列替代進口煙葉的研發(fā)工作^［4］，也取得了較大成效。然而，這些工作多集中于進口煙葉物理特性^［5］、常規(guī)化學成分、游離態(tài)香氣物質^［6-7］、感官質量、生態(tài)條件^［8-9］和加工工藝^［10］等方面，對優(yōu)質進口煙葉中的鍵合態(tài)香氣化合物缺乏系統(tǒng)研究。

香氣化合物以游離態(tài)和鍵合態(tài)2種形式存在于天然植物中，鍵合態(tài)香氣化合物是以游離態(tài)香氣成分為配體（苷元），通過糖苷鍵與糖鍵合形成^［11］。該類成分不具有揮發(fā)性，通過一定手段斷裂糖苷鍵則可將游離態(tài)苷元釋放出來，從而達到豐富、強化和改善香氣的效果^［12］。目前，國內外已有關于水果、茶葉、陳皮等不同對象中鍵合態(tài)香氣化合物的研究，但針對優(yōu)質進口煙葉中該類成分的報道較少^［13］。此外，研究進口煙葉中鍵合態(tài)香氣成分的種類和含量，并通過化學計量學方法進行有效區(qū)分，可為優(yōu)質進口煙葉的溯源和替代提供重要的數據和方法支撐。因此，本研究通過同時蒸餾萃取法去除進口煙葉中的揮發(fā)性成分，獲得煙葉水提物，采用β-葡萄糖苷酶水解煙葉水提物中糖苷鍵合態(tài)成分，制備鍵合態(tài)香氣化合物苷元，利用氣相色譜-質譜法（GC-MS）分析鍵合態(tài)香氣化合物苷元的組成。

1"材料與方法

1.1"材料、試劑與儀器

津巴布韋、巴西MBO-GX、加拿大CAO118CHC、美國2019BF1M煙葉。二氯甲烷（色譜純），山東禹王和天下新材料有限公司；β-葡萄糖苷酶（300 U/g），北京索萊寶科技有限公司；2，6-二氯甲苯（99%），百靈威科技有限公司；純凈水，娃哈哈集團有限公司。

1.2"主要儀器與設備

電子天平（GMC3002，南京伯尼塔科學儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿有限公司）；同時蒸餾萃取裝置（鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司）；調溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；磁力攪拌水浴鍋（HJ-4CS，常州普天儀器制造有限公司）；氣相色譜-質譜聯用儀（7890B-5977A，美國Agilent公司）。

1.3"實驗方法

1.3.1"試驗地點

試驗于2023年在鄭州輕工業(yè)大學煙草科學與工程學院（113.509 27°E，34.810 942°N）進行。

1.3.2"煙葉前處理

準確稱取50 g煙葉，剪碎放置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入沸石和600 mL純凈水，安裝同時蒸餾萃取裝置，裝置另一側將 100 mL 二氯甲烷放入250 mL茄形瓶中，水相第1次回流開始計時2.5 h。同時，蒸餾萃取結束后，取下圓底燒瓶，靜置冷卻，過濾。過濾后的液體即為煙葉水提物。

1.3.3"酶解煙葉

取150 mL煙葉水提物于 250 mL 藍蓋試劑瓶中，不加酶作為空白對照，加入β-葡萄糖苷酶作為處理。將空白對照與處理樣品置于磁力攪拌水浴鍋中，在50 ℃、180 r/min條件下酶解24 h。

精確量取空白對照與處理樣品10 mL置于 50 mL 離心管中，加入10 mL二氯甲烷和50 μL 2，6-二氯甲苯作為內標（濃度為0.590 3 mg/mL），200 r/min 渦旋振蕩10 min，以8 000 r/min離心 8 min，分液，得到有機相，重復上述操作2次合并有機相，有機相經過無水硫酸鈉干燥后常壓濃縮至 1 mL，用于GC-MS分析。每個樣品重復3次，結果取平均值。

1.3.4"GC-MS條件

色譜條件：Agilent DB-5MS毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進行口溫度：280 ℃；載氣：99.999% 高純度氦氣，流速：1.0 mL/min；分流比為10 ∶1，進樣量為1.0 μL。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持0 min，然后以 10 ℃/min 的升溫速度升至180 ℃，保持25 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持0 min，以0.6 ℃/min升至210 ℃，再以4 ℃/min升至280 ℃結束。

質譜條件：采用SCAN模式，傳輸線溫度 280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為 150 ℃；離子源為XTR-EI源，電子能量為70 eV；溶劑延遲時間為8 min；掃描范圍：10～800 amu。

1.3.5"數據分析

通過NIST 20譜庫檢索進行化合物定性分析；采用內標-半定量法進行定量分析；SIMCA 14.1進行OPLS-DA分析，TBtools繪制聚類熱圖。

2"結果與討論

2.1"進口煙葉中鍵合態(tài)化合物含量比較

通過GC-MS對4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物種類含量進行分析，由圖1可知，4種進口區(qū)煙葉中鍵合態(tài)香味化合物酯類、醇類含量是最多的，化合物含量高低排序為巴西gt;加拿大gt;津巴布韋gt;美國。

2.2"酶解后進口煙葉中鍵合態(tài)化合物含量分析

由酶解后不同地區(qū)煙葉中化合物含量變化結果（表1）可知，不同地區(qū)煙葉經β-葡萄糖苷酶酶解后，煙葉中的香氣化合物含量均有增加，導致煙葉中化合物含量增加的原因是β-葡萄糖苷酶使煙葉中的糖苷鍵斷裂，釋放出糖苷鍵合態(tài)化合物^［14-15］。其中，經酶處理津巴布韋、加拿大、美國、巴西煙葉中香氣化合物分別鑒定出30、31、32、26種，含量較空白對照分別增加了1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL。

4種進口優(yōu)質煙葉酶解后共檢測出11種醇類、6種酮類、醛類1種、酯類3種、酸類2種、酚類3種、雜環(huán)類6種、帖烯類3種，而醇類和酮類化合物是花果香、甜香主要香氣來源。其中，不同地區(qū)煙葉中均含有苯甲醇、苯乙醇、異佛爾醇、高香草醇、3-羥基-β-大馬士革酮、茄酮等香氣物質，這些均是對煙草香氣品質具有重要貢獻的香氣成分。除此之外，紫羅蘭醇及其衍生物是煙草中重要的香味前體物質，如3-氧代-α-紫羅蘭醇是煙草中重要香味物質，3-氧代-α-紫羅蘭醇高溫可以裂解成巨豆三烯酮^［16］，3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇可以裂解成4-（3-羥丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮，而巨豆三烯酮具有煙草香和辛香底韻，能顯著增強煙香、改善吸味、調和煙氣、減少刺激性^［17］。

酯類與酚類化合物是木香和甜香主要香氣來源，二氫獼猴桃內酯具有木香、麝香；香蘭素具有奶香、甜香；對乙烯基愈創(chuàng)木酚具有煙熏香，能賦予煙草特定的氣味，降低刺激性，使煙草香氣柔和細膩^［18］。

雜環(huán)類與烯烴類化合物是焦甜香、木香主要來源，2-乙?；量?-羥甲基糠醛具有烘烤香、焦甜香^［19］，愈創(chuàng)木烯具有木香，這些香氣成分可以賦予煙草獨特的風格特征。不同地區(qū)煙葉中鍵合態(tài)化合物含量存在差異的原因可能是，煙葉生長在不同產地、土壤、空氣、水分等環(huán)境不同，造成煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物含量存在差異。

2.3"進口煙葉中鍵合態(tài)化合物的差異性分析

為研究不同地區(qū)煙葉中鍵合態(tài)化合物含量差異，以酶解前后鍵合態(tài)化合物成分的增加量為研究對象，對不同地區(qū)煙葉中化合物含量進行主成分分析，由圖2、圖3可知，不同地區(qū)煙葉中化合物成分存在一定差異，層次聚類結果與PCA分析結果一致。

以4種進口煙葉作為自變量，4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物含量作為因變量，通過正交偏最小二乘法（OPLS-DA）對4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物進行差異分析。由圖4可知，圖4-a中模型可知不同地區(qū)煙葉鍵合態(tài)物質含量均在95%置信區(qū)間，4種進口煙葉分別位于不同象限，表示4種進口煙葉能夠得到有效區(qū)分。該模型中R²x為0.945，R²y為0.994，Q²為0.989，因自變量R²和預測指數Q²均gt;0.5，表明該模型穩(wěn)定可接受^［20］。圖4-b是經過200次置換檢驗驗證分析模型中是否存在過擬合現象，模型的預測指數Q²與y軸相交于負半軸，說明模型擬合有效，不存在過擬合現象^［21］，說明該模型能夠用于后續(xù)對4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物進行有效區(qū)分。

通過OPLS-DA分析，篩選出VIP值gt;1的18種香氣化合物，作為區(qū)分4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物成分差異性分析（圖4）。由圖5可知，顏色是從藍色到紅色的等級進行設計，相對含量從低到高逐漸遞增，便于不同地區(qū)煙葉之間差異區(qū)分。其中，津巴布韋煙葉中茄酮、對羥基苯乙醇、2-乙?；量?、香蘭素、N-甲基-2-吡咯甲醛含量較為突出；美國煙葉中（E）-松柏醇、癸醛、3-羥基-β-大馬士革酮、地黃普內酯、5-羥甲基糠醛等含量較為突出；巴西煙葉中3-羥基-5，6環(huán)氧-β-紫羅蘭醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、菜籽多酚含量較為突出；加拿大煙葉中3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內酯、1，5-二羥基-β-紫羅蘭酮、DDMP、愈創(chuàng)木烯含量較為突出，可以通過香氣化合物的成分含量差異作為鑒定區(qū)分4種進口煙葉。

煙葉的風格特征與煙葉中游離態(tài)和鍵合態(tài)香氣化合物有著密切的關系，津巴布韋煙葉香氣獨特飄逸、刺激性小可能與煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物茄酮、2-乙酰基吡咯等含量有關^［22］；美國煙葉香氣濃度飽滿可能與（E）-松柏醇、5-羥甲基糠醛、3-羥基-β-大馬士革酮等含量有關；巴西煙葉香氣清晰、香氣爆發(fā)力足可能與3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、3-氧代-5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭醇等含量有關^［13］；加拿大煙葉香氣細膩柔和、圓潤感好可能與3-氧代-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內酯等含量有關^［23］。

3"結論

采用β-葡萄糖苷酶對不同地區(qū)煙葉水提物進行酶解，利用氣相色譜-質譜法分析不同地區(qū)煙葉中糖苷鍵合態(tài)化合物成分，得出結論：（1）經酶處理津巴布韋、加拿大、美國、巴西煙葉中香氣化合物分別鑒定出30、31、32、26種，含量較空白對照分別增加了1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL；（2）主成分和層次聚類分析結果表明，4種進口煙葉鍵合態(tài)化合物成分含量存在較大差異；（2）對VIP值gt;1 的化合物，通過OPLS-DA對不同煙葉中鍵合態(tài)化合物含量進行分析，共篩選出4種進口煙葉中18種差異鍵合態(tài)香氣化合物，其中，津巴布韋煙葉中含量較為突出的有5種香氣化合物，包括茄酮、對羥基苯乙醇、2-乙酰基吡咯、香蘭素、N-甲基-2-吡咯甲醛；加拿大煙葉中含量較為突出的有5種香氣化合物，包括3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內酯、1，5-二羥基-β-紫羅蘭酮、DDMP、愈創(chuàng)木烯；美國煙葉種含量較為突出的有5種香氣化合物，包括（E）-松柏醇、癸醛、3-羥基-β-大馬士革酮、地黃普內酯、5-羥甲基糠醛；巴西煙葉中含量較為突出的有3種香氣化合物，包括 3-羥基-5，6環(huán)氧-β-紫羅蘭醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、菜籽多酚。

本研究通過化學計量法對4種進口煙葉中鍵合態(tài)香氣成分的種類和含量進行對比分析，初步明確了4種進口煙葉中18種差異香氣化合物。本研究方法能有效表征4種進口煙葉產地的特征香氣成分，可以用于煙葉產地溯源。

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