許春平++冉盼盼++曾穎++譚蘭蘭++申屠洪釬++馬擴(kuò)彥++戴亞

摘要：采用堿溶酸沉法從烤煙低次煙葉中提取蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，檢測其中蛋白質(zhì)含量為350 mg/g，多酚成分包括綠原酸、莨菪葶、蕓香苷，其含量分別為2.1、0.5、2.9 mg/g。對(duì)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物進(jìn)行抗氧化性檢測。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，DPPH·自由基與OH·自由基的清除率隨復(fù)合物濃度的增加而升高；對(duì)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物的抗氧化性測試結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的延長，復(fù)合物對(duì)DPPH·自由基與OH·自由基的清除活性均呈下降趨勢，說明蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合狀態(tài)下才能保持蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的抗氧化性，而且其抗氧化性可能主要來源于復(fù)合物中的多酚。

關(guān)鍵詞：低次煙葉；蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物；酶解；抗氧化性

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）03-0531-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.035

Analysis of Composition and Antioxidant Activity of Protein-polyphenol Complex from Discarded Tobacco Leaves

XU Chun-ping1，RAN Pan-pan1，ZENG Ying1，TAN Lan-lan2，SHENTU Hong-qian2，MA Kuo-yan3，DAI Ya3

（1.College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2.Technical Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Co. Ltd.， Chengdu 610066，China；

3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co. Ltd.， Chongqing 400060，China）

Abstract： The protein-polyphenol complex was extracted from discarded tobacco leaves by alkali-solution and acid-isolation method. The protein content was detected as 350 mg/g and polyphenol components including chlorogenic acid， scopoletin and rutin， and their contents were 2.1 mg/g， 0.5 mg/g， and 2.9 mg/g， respectively. The antioxidant tests of protein-polyphenol complex showed that in a certain range， the scavenging rate of DPPH· radical and OH· radical increased with the increase of the concentration. The scavenging activity of DPPH· radical and OH· radical was decreased with the time of enzymatic hydrolysis. The results indicated that the antioxidant activity of protein-polyphenol can maintain with the binding stage of protein and polyphenol， and the main source of antioxidant activity could be from polyphenols.

Key words： discarded tobacco； protein polyphenol complex； enzymatic hydrolysis； antioxidant activity

中國是煙草種植大國，也是卷煙生產(chǎn)大國，同時(shí)每年產(chǎn)生的低次煙葉也數(shù)量龐大，有效利用這些廢料既可以保護(hù)環(huán)境，減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)，也能創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。煙葉蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，作為食用蛋白質(zhì)來說它比雞蛋、乳酪和牛奶更適合人體吸收利用，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。Kung等[2]、Lowe[3]對(duì)煙葉FI蛋白質(zhì)進(jìn)行了提純。趙謀明等[4]使用堿溶酸沉法工藝對(duì)煙葉蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。研究表明，提取出的蛋白質(zhì)是一種蛋白質(zhì)多酚復(fù)合物[5]，其中多酚成分對(duì)其生物活性有較大影響。林曉婕等[5]從煙葉中提取出色素蛋白質(zhì)復(fù)合物，表明其中多酚物質(zhì)對(duì)其抗紫外活性起主要作用。王潔[6]研究表明，蛋白質(zhì)與多酚以非共價(jià)形式結(jié)合。本試驗(yàn)對(duì)提取的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的組成進(jìn)行分析，檢測其抗氧化活性，并分析其組成對(duì)抗氧化活性的影響，以期為煙葉蛋白質(zhì)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

低次烤煙葉粉末（2013年河南襄縣產(chǎn)豫煙10號(hào)X3L等級(jí)煙葉）。濃鹽酸、Tris、無水乙醇、磷酸、DPPH、鄰二氮菲、PBS磷酸鹽、硫酸亞鐵、H2O2（30%）以上試劑均為分析純；甲醇、乙酸為色譜級(jí)；綠原酸、蕓香苷、莨菪葶為標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；中性蛋白酶（200 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）（江蘇銳陽生物科技有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（西安國安生物科技有限公司）；回流裝置、水浴鍋、低速離心機(jī)（湘儀TDZ5-WS型）、紫外分光光度計(jì)（UV1700PC型）、Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、色譜柱為Waters Symme-try C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的提取 按照堿溶酸沉法提取低次煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物[4，7]，低次煙葉打粉過篩，按料液比1∶30（m∶V，下同）加入去離子水，將pH調(diào)至8，在50 ℃溶解30 min，以3 000 r/min離心15 min，取上清液調(diào)pH至3，酸沉1 h，再3 000 r/min離心15 min得到沉淀，冷凍干燥即為蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[8]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確配制100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用去離子水補(bǔ)至1 mL，然后加入考馬斯亮藍(lán)G-250 5 mL，搖勻，放置5 min，在585 nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品檢測：準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后的蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物0.1 g，將樣品稀釋1 000倍，取1 mL用考馬斯亮藍(lán)法測定其吸光度，方法同上，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)含量。計(jì)算公式為蛋白質(zhì)含量（mg/g）=（蛋白質(zhì)濃度×稀釋倍數(shù)/1000）/0.1。

1.2.3 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚含量的測定 用HPLC對(duì)低次煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚含量進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取1.00 g蛋白質(zhì)復(fù)合物，加入150 mL 80%甲醇，回流40 min，取1 mL，通過0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣[5]。

定性試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液為80%甲醇配制的0.1 mg/mL綠原酸、0.005 mg/mL莨菪葶、0.1 mg/mL蕓香苷。設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)樣品為1號(hào)，樣品組為2號(hào)，樣品組加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)樣品為3號(hào)，進(jìn)行試驗(yàn)。

外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將配制好的綠原酸分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL，相同條件下進(jìn)樣；將上述莨菪葶、蕓香苷也分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL進(jìn)行測定。多酚含量計(jì)算方法：多酚含量（mg/g）=多酚濃度×150。

色譜條件：流動(dòng)相A為水∶甲醇∶乙酸=88∶10∶2（體積比），流動(dòng)相B為水∶甲醇∶乙酸=10∶88∶2（體積比）。柱溫30 ℃，柱流量1 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。梯度0 min，流動(dòng)相A 為100%；16.5 min，A為80%，B為20%；30 min，A為20%，B為80%。檢測器為DAD，檢測波長340 nm，參比波長480 nm，分析時(shí)間40 min[9]。

1.2.4 煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物抗氧化能力的測定 采用DPPH法測定低次煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)DPPH·自由基的清除能力[10]。采用鄰二氮菲法測定低次煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)OH·自由基的清除能力[11]。

1.2.5 酶解蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的抗氧化性測定 用中性蛋白酶和堿性蛋白酶1∶1的混合酶，在60 ℃、pH=7、加酶量0.001 g的條件下，對(duì)樣品進(jìn)行酶解，每20 min取一次樣，對(duì)酶解液進(jìn)行抗氧化性檢測，方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均數(shù)比較采用Student-t檢驗(yàn)，顯著性水平P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)含量

以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程y=0.009 8x+0.044 2，R2=0.992 8。測得稀釋后的樣品吸光度為0.387，由方程及稀釋倍數(shù)得到蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)含量為350 mg/g。

2.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚的檢測

采用HPLC檢測蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚，結(jié)果如圖2所示。樣品中3種成分與標(biāo)樣中物質(zhì)保留時(shí)間相似，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)一步說明該物質(zhì)與標(biāo)樣中物質(zhì)相同，根據(jù)保留時(shí)間依次為綠原酸、莨菪葶、蕓香苷，其比例與烤煙煙葉中游離態(tài)多酚比例相似[10]。

以不同濃度的標(biāo)樣進(jìn)行外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為綠原酸y=3×10-5x（R2=0.992 1）、莨菪葶y=1×10-5x（R2=0.995）、蕓香苷y= 4×10-5x（R2=0.991 3），通過方程得到綠原酸濃度為0.014 0 mg/mL，莨菪葶濃度為0.003 3 mg/mL，蕓香苷濃度為0.019 0 mg/mL，從而計(jì)算出蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚含量分別為2.1、0.5、2.9 mg/g。

2.3 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的抗氧化能力

2.3.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)DPPH·自由基的清除能力 對(duì)于不同蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度及不同水解程度進(jìn)行DPPH·自由基清除試驗(yàn)，樣品稀釋為蛋白質(zhì)濃度3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、70.0、116.7、175.0 μg/mL。從圖3可以看出，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物在較低濃度時(shí)就可清除DPPH·自由基，在3.5～35.0 μg/mL，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)DPPH·自由基的清除效率與蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，也就是隨著低次煙葉蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度的增加，對(duì)DPPH·自由基的清除率增大（P<0.05），當(dāng)濃度為35.0 μg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)DPPH·自由基的清除率達(dá)到89.7%，之后隨著蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度的增加，對(duì)DPPH·自由基的清除率增加不顯著（P>0.05）。

用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物進(jìn)行酶解，其對(duì)DPPH·自由基的清除效果如圖4所示。隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)的水解程度越高，對(duì)DPPH·自由基的清除活性呈下降趨勢（P<0.05）。蛋白酶的水解作用僅僅是針對(duì)蛋白質(zhì)中的肽鍵，而對(duì)其功能基團(tuán)不會(huì)破壞，水解后蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物活性的降低表明其抗氧化活性來源并不是蛋白質(zhì)。結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中多酚的檢測，可以推斷蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的強(qiáng)抗氧化活性可能來源于多酚的作用[12]，而其結(jié)合形式為非共價(jià)結(jié)合[13]。蛋白質(zhì)的水解使其與多酚的結(jié)合被破壞，失去蛋白質(zhì)的結(jié)合后多酚的抗氧化活性不宜保持，從而導(dǎo)致了復(fù)合物抗氧化活性的下降。

2.3.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對(duì)OH·自由基的清除能力 對(duì)不同蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度及不同水解程度進(jìn)行OH·自由基清除試驗(yàn)，將樣品稀釋為蛋白濃度分別為3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、43.8、58.5、87.5、175.0、350.0、700.0 μg/mL，樣品蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白濃度與清除羥基自由基的能力如圖5所示。與蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物清除DPPH·自由基的清除效果相似，在較低濃度時(shí)，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物就可清除羥基自由基，在4.4～175.0 μg/mL時(shí)，隨著蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度的升高，對(duì)羥基自由基的清除率也升高（P<0.05），當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)濃度為175.0 μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為79.55%，之后隨著蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率增加不顯著（P>0.05）。

采用蛋白酶酶解蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中蛋白質(zhì)水解程度增大，對(duì)OH·自由基的清除率呈下降趨勢（P<0.05）（圖6）。這與之前對(duì)DPPH·自由基的清除結(jié)果相似，也進(jìn)一步證明蛋白復(fù)合物中含有多酚，可能與其非共價(jià)結(jié)合，這種結(jié)合態(tài)使得多酚更加穩(wěn)定，使蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物具有抗氧化性，在蛋白質(zhì)被水解后，這種復(fù)合物被破壞，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物抗氧化性降低。

3 小結(jié)

堿溶酸沉法提取低次煙葉中蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，對(duì)其進(jìn)行成分分析，其蛋白質(zhì)含量為350 mg/g，多酚中綠原酸2.1 mg/g，莨菪葶0.5 mg/g，蕓香苷2.9 mg/g。對(duì)其進(jìn)行抗氧化性檢測，結(jié)果表明，其抗氧化活性隨著蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物濃度增大而增大，蛋白質(zhì)酶解后隨著酶解時(shí)間的增加抗氧化活性降低，表明蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物中抗氧化活性可能主要來源于與其非共價(jià)結(jié)合的多酚，且在結(jié)合的狀態(tài)下才能保持蛋白復(fù)合物的抗氧化活性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊 亞，朱列書，馮連軍，等.從硒對(duì)人類健康的作用看煙草硒蛋白的發(fā)展前景[J].作物研究，2009（5）：355-359.

[2] KUNG S D，SAUNDERS J A，TSO T C，et al. Tobacco as a potential food source and smoke material：Nutritional evaluation of tabacco leaf protein[J].Beitr Tabakaforsch Int，1980，45（2）：320-322.

[3] LOWE R H. Crystallization of fraction I protein of tobacco by a simplified procedure[J].FEBS Letter，1977，78：98-100.

[4] 趙謀明，饒國華，林偉鋒，等.低次煙葉中蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化及氨基酸分析研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006（1）：142-146.

[5] 林曉婕，傅 紅，楊 琳，等.煙草色素蛋白復(fù)合物中多酚類物質(zhì)對(duì)其抗紫外性能的影響[J].中國煙草科學(xué)，2011（2）：57-61.

[6] 王 潔.多酚-蛋白質(zhì)相互作用的影響因素及其功能特性研究進(jìn)展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012（3）：91-96.

[7] 張 恒.幾種糧食類植物蛋白分離方法[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，1997（4）：40-42.

[8] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.

[9] YC/T 202-2006，煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、莨菪葶和蕓香苷的測定[S].

[10] 勾明玥，劉 梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（3）：148-150.

[11] 付林林，郭玉華.六種中藥抗羥自由基活性研究[J].安陽工學(xué)院學(xué)報(bào)，2010（4）：26-27.

[12] 闞茗銘，葉發(fā)銀，趙國華.多酚-蛋白質(zhì)共價(jià)作用及其對(duì)食品體系的影響研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2015（1）：245-249.

[13] 張 曼，王岸娜，吳立根，等.蛋白質(zhì)、多糖和多酚間相互作用及研究方法[J].糧食與油脂，2015（4）：42-46.