摘要：為探討沙門氏菌感染對(duì)番鴨的影響，擬通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析沙門氏菌感染番鴨后不同時(shí)間法氏囊組織的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用腸炎沙門氏菌感染14 d雛番鴨，感染后1、3、10 d采集試驗(yàn)組和對(duì)照組法氏囊組織樣本，提取RNA，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析鑒定不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組變化、信號(hào)通路和功能。結(jié)果表明，在番鴨感染沙門氏菌1、3、10 d分別發(fā)現(xiàn)9、97、4個(gè)差異基因（Plt;0.05，|log2 fold change|gt;1）。GO分析結(jié)果表明，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中這些差異基因在生物學(xué)進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞部分均有富集。KEGG分析結(jié)果表明，感染1 d時(shí)，差異基因主要富集于集合管的酸分泌、霍亂弧菌感染、癌癥通路中；感染3 d時(shí)，差異基因主要富集于代謝信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控及IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)；感染10 d，差異基因主要富集在亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多種疾病的神經(jīng)退行性途徑。其中，沙門氏菌感染1 d的差異基因ATP6V0A4，沙門氏菌感染3 d的差異基因IL-15、PTGS2、IGHV3-23主要參與了這些信號(hào)通路，提示這些基因可能在番鴨沙門氏菌感染過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；番鴨；法氏囊；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

中圖分類號(hào)：S858.32""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0179-07

沙門氏菌是一種常見的食源性人畜共患致病菌，該菌引起的沙門氏菌病對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。沙門氏菌感染番鴨、引起發(fā)病的情況也多有報(bào)道，如2010年貴州省貴陽(yáng)市某番鴨養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)番鴨在15日齡時(shí)發(fā)病，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為細(xì)小病毒和沙門氏菌混合感染^［1］。2012年，貴州省習(xí)水縣報(bào)道一番鴨場(chǎng)引進(jìn)的雛番鴨在7日齡時(shí)發(fā)生鴨沙門氏菌感染^［2］。2014年，福建某番鴨場(chǎng)發(fā)生疑似沙門氏菌病，經(jīng)細(xì)菌分離與鑒定確定為沙門氏菌感染^［3］。2022年，在廣西一養(yǎng)殖場(chǎng)番鴨出現(xiàn)大批死亡，經(jīng)診斷為沙門氏菌與鴨疫里默氏菌混合感染^［4］。但沙門氏菌的發(fā)病機(jī)制不完全清楚，有研究表明，腸炎沙門氏菌感染雛鴨的法氏囊和胸腺病理變化不明顯，脾臟壞死明顯^［5］。但也有報(bào)告稱，分離出的沙門氏菌HP-2感染雛鴨的脾臟和胸腺?zèng)]有嚴(yán)重?fù)p傷，僅肝臟和心臟表面覆蓋大量黃白色物質(zhì)^［6］。

法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，在禽類的免疫反應(yīng)中具有重要作用，在快速生長(zhǎng)期切除法氏囊，會(huì)降低沙門氏菌的抗體反應(yīng)^［7］。鴨感染腸炎沙門氏菌后，對(duì)其法氏囊進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn)，法氏囊濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯減少^［8］。RT-PCR方法檢測(cè)沙門氏菌感染鴨免疫器官的分布和細(xì)菌載量的試驗(yàn)表明，沙門氏菌感染后24～36 h，脾臟、血液和哈德氏腺中含有高濃度的細(xì)菌載量，而法氏囊和胸腺中細(xì)菌載量較低^［9］。以上結(jié)果說(shuō)明，沙門氏菌感染會(huì)影響鴨法氏囊的病理變化和免疫反應(yīng)。

目前，雖然多有番鴨感染沙門氏菌的報(bào)道，但主要限于對(duì)細(xì)菌的分離鑒定及診斷等病例報(bào)道，相關(guān)機(jī)制研究較少，本研究通過對(duì)感染沙門氏菌的番鴨法氏囊組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析感染不同時(shí)間番鴨法氏囊組織中的基因變化情況，以期為番鴨的沙門氏菌感染分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1"番鴨沙門氏菌人工感染

本研究于2022年6—7月在江蘇省家禽科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行徹底消毒，所有試驗(yàn)用品和動(dòng)物廢料進(jìn)行高壓消毒后廢棄。取鴨腸炎沙門氏菌菌株50336 1 μL（來(lái)自于揚(yáng)州大學(xué)），加入至添加有5%血清的TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。1 000 r/min離心 10 min 后去上清，采用生理鹽水將沉淀稀釋為 10⁹"CFU/mL，每羽番鴨皮下注射0.5 mL，對(duì)照組鴨注射相同劑量的生理鹽水。

1.1.2"分組和樣品采集

在沙門氏菌人工感染的1、3、10 d，每組隨機(jī)選取4羽鴨空腹稱重后屠宰，采集法氏囊組織，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)照組分別為 FC-1 組（FC1、FC2、FC3、FC4），F(xiàn)C-2組（FC5、FC6、FC7、FC8），F(xiàn)C-3組（FC9、FC10、FC11、FC12），感染組分別為FE-1組（FE1、FE2、FE3、FE4），F(xiàn)E-2組（FE5、FE6、FE7、FE8），F(xiàn)E-3組（FE9、FE10、FE11、FE12）。

1.2"轉(zhuǎn)錄組上機(jī)測(cè)序樣品的制備

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程如下：使用Trizol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取總RNA，在Agilent 2100生物分析儀上評(píng)估RNA質(zhì)量（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），并使用無(wú)RNase瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。提取總RNA后，采用Oligo（dT）富集真核細(xì)胞mRNA，使用NEBNext Ultra RNA文庫(kù)制備試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。純化的雙鏈cDNA片段末端修復(fù)，添加A堿基，并連接到Illumina測(cè)序儀器，采用AMPure XP珠（1.0X）純化連接反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行大小選擇，使用Illumina Novaseq 6000對(duì)所得cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3"轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

由Illumina Novaseq 6000測(cè)序獲得Raw Reads或Raw Data，隨后對(duì)Raw Reads進(jìn)行質(zhì)控（QC），確定測(cè)序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到Clean Reads，采用tophat/bowtie2將Clean Reads比對(duì)到參考序列［Ensembl：Muscovy Duck（domestic type）CaiMos1.0］。比對(duì)完通過統(tǒng)計(jì)Reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，進(jìn)行第二次質(zhì)控。隨后再進(jìn)行基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)及編碼能力預(yù)測(cè)、SNP檢測(cè)等一系列后續(xù)分析，并從基因表達(dá)結(jié)果中，篩選出樣品間差異表達(dá)的基因，基于差異表達(dá)基因，進(jìn)行聚類分析、GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析。

將差異表達(dá)基因（DEG）列表提交至Blast 2GO軟件包進(jìn)行GO分析，確定和比較基因的功能。GO中差異基因Plt;0.05被認(rèn)為是顯著富集。Unigenes的KEGG通路分析采用在線KEGG Automatic Annotation Server （KAAS；http：//www.genome.jp/kegg/kaas/）分析軟件分析。在所有的檢驗(yàn)中，P值的計(jì)算采用Benjamini-corrected modified Fisher^，s精確檢驗(yàn)，并且Plt;0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2"結(jié)果與分析

2.1"測(cè)序數(shù)據(jù)概況

由表1可知，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序每個(gè)個(gè)體獲得的Raw Reads數(shù)在37 916 022～60 898 084之間，經(jīng)過濾得到的Clean Reads數(shù)在37 630 284～60 426 566之間，過濾率為99.0%以上，對(duì)比到基因組上的比對(duì)率為86.32%以上，Q30在90.0%以上，說(shuō)明所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量佳。

2.2"沙門氏菌感染番鴨不同時(shí)間組差異分析

由表2可知，沙門氏菌感染番鴨后1 d，感染組和對(duì)照組間的差異基因?yàn)?個(gè)，其中上調(diào)基因8個(gè)，下調(diào)基因1個(gè)；感染后3 d，感染組和對(duì)照組間的差異基因?yàn)?7個(gè)，其中，上調(diào)基因86個(gè)，下調(diào)基因11個(gè)；感染后10 d，感染組和對(duì)照組間的差異基因?yàn)?個(gè)，全為上調(diào)基因。

2.3"沙門氏菌感染番鴨差異基因概況

由表3可知，沙門氏菌感染番鴨1 d，感染組與對(duì)照組間排名前10的差異基因主要包括：細(xì)胞代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因CTBP2、PDK4、ATP6V0A4、KLF15；與細(xì)胞免疫相關(guān)的基因IGLV3-19和KLRB1，以及與細(xì)胞周期相關(guān)的基因ZBTB16。沙門氏菌感染番鴨3 d，感染組和對(duì)照組間排名前10的差異基因主要包括與代謝相關(guān)的基因PLIN1、FABP4、SGPP2、DHRS4；與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因IL15、IGHV3-23、PTGS2、ATP6V1G3，與細(xì)胞增殖、分化有關(guān)的MC5R、BLVRB基因。在沙門氏菌感染番鴨 10 d，感染組與對(duì)照組間的差異基因TECTA與聽力損傷有關(guān)，MSTRG.5870、ENSCMMG00000013903、MSTRG.4971為新發(fā)現(xiàn)基因，功能未知。

2.4"沙門氏菌感染番鴨不同組間差異基因GO分析

由表4可知，沙門氏菌感染番鴨1、3、10 d排名前10的GO條目，差異基因在生物學(xué)進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞部分均有富集，其中，沙門氏菌感染番鴨 1 d， 生物學(xué)進(jìn)程中富集條目有代謝過程、 生物學(xué)過程調(diào)節(jié)和生物學(xué)調(diào)節(jié)等；分子功能中富集條目有結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和催化活性條目等；細(xì)胞部分中富集條目為細(xì)胞解剖學(xué)實(shí)體和含蛋白質(zhì)復(fù)合物。沙門氏菌感染3 d，生物學(xué)進(jìn)程中富集的條目有細(xì)胞過程、代謝過程、生物學(xué)調(diào)節(jié)等；分子功能中富集的條目有結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性；細(xì)胞部分中富集的條目為細(xì)胞解剖學(xué)實(shí)體和含蛋白質(zhì)復(fù)合物。沙門氏菌感染番鴨10 d，生物學(xué)進(jìn)程中富集條目有細(xì)胞過程、多細(xì)胞生物過程、生物學(xué)黏附等；分子功能中富集的條目為結(jié)合；細(xì)胞部分富集的條目為細(xì)胞解剖學(xué)實(shí)體。

2.5"沙門氏菌感染番鴨不同組間差異基因KEGG分析

由表5可知，沙門氏菌感染番鴨1 d，ATP6V0A4參與了排名前10的信號(hào)通路中集合管的酸分泌、霍亂弧菌感染、急性髓細(xì)胞白血病、幽門螺桿菌感染中上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、突觸囊泡周期、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多個(gè)信號(hào)通路，CTBP2參與了癌癥途徑、Notch信號(hào)通路和慢性粒細(xì)胞白血病通路，ZBTB16參與癌癥途徑和氧化磷酸化信號(hào)通路。沙門氏菌感染番鴨3 d，在排名前10的信號(hào)通路中參與代謝通路的基因最多，為14個(gè)，其次為脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控通路，為4個(gè)。與免疫相關(guān)的信號(hào)通路有：IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、PPAR信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、致病性大腸桿菌感染、P13K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用，參與的基因包括IL-5、IGHV3-23、HBAD、Atp6v1g3、FABP4、PLIN1、PTGS2、CLDN10、DDIT4；參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用的差異基因?yàn)镃HRNB4和MC5R。沙門氏菌感染番鴨10 d，涉及的信號(hào)通路僅有3條，分別為亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多種疾病的神經(jīng)退行性途徑，差異基因均為MSTRG.5870。

3"討論

通過鼠傷寒沙門氏菌LPS誘導(dǎo)雛雞急性法氏囊萎縮的研究表明，LPS刺激可導(dǎo)致法氏囊炎癥變化、結(jié)構(gòu)破壞；轉(zhuǎn)錄組分析表明，LPS刺激早期誘導(dǎo)的雛雞法氏囊微觀形態(tài)變化可能受到LPS/TLR4/MAPK信號(hào)途徑中下游活化的轉(zhuǎn)錄分子CNN1、E2F1和HRAS的調(diào)節(jié)^［10］。鼠沙門氏菌感染雞后，雞法氏囊中TLR4和相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)發(fā)生改變^［11］。腸炎沙門氏菌感染雞后不同時(shí)間盲腸組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，在感染后1、3、7、14 d差異表達(dá)的基因分別為529、1 477、476、432個(gè)。1 d時(shí)，差異表達(dá)基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體互作、吞噬體、PPAR信號(hào)通路；3 d差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作、Toll樣受體信號(hào)通路、視黃醇代謝信號(hào)通路；7 d差異表達(dá)基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、α-亞麻酸代謝信號(hào)通路，14 d差異表基因主要富集在組氨酸代謝、MAPK信號(hào)通路^［12］。RNA-seq 技術(shù)檢測(cè)雞腸炎沙門氏菌抗性相關(guān)基因的研究表明，抗性組和抗病組相比共有137個(gè)差異基因，抗病組和易感組相比共有176個(gè)差異基因，對(duì)照組和易感組相比共有270個(gè)差異基因。差異基因主要富集在炎癥因子與其受體相互作用，NOD樣受體信號(hào)通路、JAK-STAR信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路^［13］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序的方法檢測(cè)番鴨感染鴨疫里默氏菌后不同時(shí)間的基因表達(dá)變化結(jié)果表明， 在感染的1、3、10 d， 差異基因分別為9、97、4個(gè)，富集的信號(hào)通路包括：Notch信號(hào)通路、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、PPAR信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路等免疫相關(guān)信號(hào)通路，但未富集到TLR、NOD等信號(hào)通路，對(duì)腸炎沙門氏菌的免疫反應(yīng)存在差異可能與物種、組織以及沙門氏菌菌株的不同有關(guān)。

沙門氏菌感染番鴨后1 d，差異基因中參與信號(hào)通路最多的為ATP6v0A4基因，研究發(fā)現(xiàn)，該基因突變導(dǎo)致原發(fā)性常染色體隱性遺傳性遠(yuǎn)端腎小管酸中毒^［14-15］。信號(hào)通路分析表明，該基因還參與霍亂弧菌、幽門螺桿菌感染等與免疫相關(guān)的信號(hào)通路，本研究首次在番鴨沙門氏菌感染中發(fā)現(xiàn)該差異基因，提示該基因在番鴨沙門氏菌的感染過程中也發(fā)揮重要作用。沙門氏菌感染3 d，差異基因主要參與代謝通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控、PPAR信號(hào)通路等代謝相關(guān)的信號(hào)通路，且參與代謝通路的差異基因最多，提示番鴨感染沙門氏菌后可能會(huì)引起其代謝的改變。另外，差異基因還參與多條與免疫相關(guān)的信號(hào)通路，差異基因主要包括IL-15、PTGS2、IGHV3-23等。IL-15是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和分化^［16-18］，還與IL-12協(xié)同刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-r^［19］，還能夠刺激巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，并且自身具有促炎特性^［20］。研究表明，IL-15的表達(dá)在組織被破壞和感染的條件下上調(diào)^［21-22］。且IL-15參與NK和T細(xì)胞介導(dǎo)的大腸埃希氏菌感染^［23-24］"。內(nèi)源性IL-15還通過激活NK細(xì)胞和產(chǎn)生IFN-r，在早期預(yù)防霍亂鏈球菌感染方面具有重要作用^［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-15為參與番鴨感染沙門氏菌3 d差異前10位KEGG中的一個(gè)重要基因，參與了IgA小腸免疫網(wǎng)絡(luò)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、TNF信號(hào)通路，在鴨的沙門氏菌感染過程中可能發(fā)揮重要作用。有研究表明，LPS誘導(dǎo)的PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2）通過NF-kB調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)^［26］，本研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了TNF信號(hào)通路和NF-kB信號(hào)通路，提示PTGS2可能是通過這2種信號(hào)通路參與番鴨沙門氏菌感染后的炎性反應(yīng)過程。研究表明，在新冠肺炎病人中，IGHV3-23（免疫球蛋白重量變量3家族成員23）作為B細(xì)胞的受體發(fā)揮作用^［27］；且IGHV3-23的突變與B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病有關(guān)^［28］，本研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了番鴨的IgA腸道網(wǎng)絡(luò)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、NF-kb信號(hào)通路、大腸桿菌感染、P13K-Akt信號(hào)通路等信號(hào)途徑，提示該基因在番鴨的沙門氏菌感染過程中具有重要作用。PLIN1、脂滴包被蛋白1，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解、細(xì)胞代謝及線粒體功能中發(fā)揮作用^［28］。在沙門氏菌感染番鴨10 d，僅涉及3個(gè)信號(hào)通路，1個(gè)差異基因，且差異基因功能未知，提示番鴨沙門氏菌感染10 d時(shí)已基本恢復(fù)健康。

綜上，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了沙門氏菌感染番鴨1、3、10 d法氏囊組織中基因表達(dá)情況，獲得了個(gè)體的測(cè)序數(shù)據(jù)，分別篩選出9、97、4個(gè)差異基因，說(shuō)明在沙門氏菌感染番鴨3 d時(shí)，感染與抗感染反應(yīng)最強(qiáng)。其中，ATP6V0A4可能通過參與細(xì)菌感染、炎性相關(guān)信號(hào)通路，IL15、PTGS2、IGHV3-23 等可能通過參與代謝通路和免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)沙門氏菌感染番鴨過程中，研究結(jié)果可為番鴨的沙門氏菌感染與抗感染機(jī)制研究提供理論參考。

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