摘要目的：探討長鏈非編碼RNA DNA損傷誘導(dǎo)的非編碼RNA（LncRNA NORAD）通過miR-513b-5p/GREM1軸調(diào)節(jié)顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖、遷移、侵襲和凋亡的機(jī)制。方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測人顱內(nèi)動脈瘤組織和正常組織中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表達(dá)。體外分離培養(yǎng)人VSMC，隨機(jī)分為對照組、LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組、共轉(zhuǎn)染（LncRNA NORAD siRNA＋miR-513b-5p inhibitor）組、共轉(zhuǎn)染陰性對照（LncRNA NORAD siRNA陰性對照＋miR-513b-5p inhibitor陰性對照）組，分組轉(zhuǎn)染后，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)；采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）和免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞增殖情況；采用Hoechst 33342染色和免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞凋亡情況；采用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測各組細(xì)胞遷移、侵襲情況；采用免疫印記實驗檢測各組細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志蛋白神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、E-鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達(dá)；采用雙熒光素酶報告實驗分析VSMC中LncRNA NORAD對miR-513b-5p、miR-513b-5p對GREM1的靶向調(diào)控。結(jié)果：與正常組織比較，顱內(nèi)動脈瘤組織LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組細(xì)胞GREM1 mRNA表達(dá)、增殖率、Ki67陽性率、遷移率、侵襲數(shù)及N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GREM1 mRNA表達(dá)、增殖率、Ki67陽性率、遷移率、侵襲數(shù)及N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論：敲低LncRNA NORAD可通過上調(diào)miR-513b-5p表達(dá)而降低GREM1表達(dá)，從而抑制VSMC增殖與侵襲遷移，并促使其凋亡。

關(guān)鍵詞顱內(nèi)動脈瘤；長鏈非編碼RNA DNA損傷誘導(dǎo)的非編碼RNA，LncRNA NORAD；miR-513b-5p；GREM1；血管平滑肌細(xì)胞；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.15.012

LncRNA NORAD Regulates the Proliferation， Migration， Invasion， and Apoptosis of Intracranial Aneurysm Vascular Smooth Muscle Cells through the miR-513b-5p/GREM1 Axis

HUANG Rui， CHEN Haijun， WEI Zongdang， QIN Guowen， ZHONG Shu， PANG Gang

The People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530016， Guangxi， China

Corresponding AuthorPANG Gang， E-mail： libzq20@163.com

AbstractObjective：To study the mechanism of long non-coding RNA DNA damage induced non-coding RNA（LncRNA NORAD） regulating the proliferation， migration，invasion，and apoptosis of vascular smooth muscle cells（VSMC） in intracranial aneurysm（IA） through the miR-513b-5p/GREM1 axis.Methods：Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of LncRNA NORAD，miR-513b-5p，and GREM1 in human intracranial aneurysm tissue and normal tissue.Human vascular smooth muscle cells（VSMCs） were isolated，cultured in vitro，and randomly separated into control group，LncRNA NORAD siRNA group，miR-513b-5p mimics group，co-transfection（LncRNA NORAD siRNA＋miR-513b-5p inhibitor） group，and co-transfection negative control（LncRNA NORAD siRNA negative control＋miR-513b-5p inhibitor negative control） group.After grouping and transfection，real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of LncRNA NORAD，miR-513b-5p，and GREM1 mRNA of cells in each group.The proliferation of cells in each group was detected by CCK-8 method and immunofluorescence staining.Hoechst 33342 staining and immunofluorescence staining were used to detect cell apoptosis in each group.Cell migration and invasion in each group were detected by cell scratch assay and Transwell assay.The expression of EMT marker proteins N-cadherin，E-cadherin，and Vimentin of cells in each group was detected by western Blotting.Dual-luciferase reporter assay was used to analyze the targeting regulation of miR-513b-5p by LncRNA NORAD and the targeted regulation of GREM1 by miR-513b-5p in VSMC.Results：Compared with normal tissue，the expression of LncRNA NORAD and GREM1 mRNA in intracranial aneurysm tissue obviously increased（P＜0.05），and the expression of miR-513b-5p" obviously decreased（P＜0.05）.Compared with control group，the expression of GREM1 mRNA，proliferation rate， Ki67 positive rate，migration rate，invasion number，and the expression of N-cadherin and Vimentin proteins in cells decreased in LncRNA NORAD siRNA group and miR-513b-5p mimics group（P＜0.05），the expression of miR-513b-5p，apoptosis rate，Bax/Bcl-2，and the expression of E-cadherin protein increased（P＜0.05）;there was no obvious difference in each index in the co-transfection negative control group（P＞0.05）.Compared with LncRNA NORAD siRNA group，the expression of GREM1 mRNA，proliferation rate，Ki67 positive rate，migration rate，invasion number，and the expression of N-cadherin and Vimentin proteins in cells increased in the co-transfection group（P＜0.05），the expression of miR-513b-5p，apoptosis rate，Bax/Bcl-2，and the expression of E-cadherin protein decreased（P＜0.05）.Conclusion：Knockdown of LncRNA NORAD can reduce the expression of GREM1 by up-regulating the expression of miR-513b-5p，thereby inhibiting the proliferation，invasion，and migration of VSMCs，and promoting their apoptosis.

Keywordsintracranial aneurysm; long non-coding RNA DNA damage induced non-coding RNA， LncRNA NORAD; miR-513b-5p; GREM1; vascular smooth muscle cell; experimental study

顱內(nèi)動脈瘤（intracranial aneurysm，IA）是好發(fā)于顱內(nèi)動脈分叉部位的一種動脈管壁擴(kuò)張性疾病，由顱內(nèi)血管受到刺激發(fā)生異常增生引起，早期癥狀不明顯，但隨著病情進(jìn)展瘤體會破裂導(dǎo)致腦出血，具有高致殘率、致死率特性，極大威脅人類健康［1-2］。長鏈非編碼RNA DNA損傷誘導(dǎo)的非編碼RNA（long non-coding RNA non-coding RNA activated by DNA damage，LncRNA NORAD）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與調(diào)控顱內(nèi)動脈瘤的形成發(fā)展，上調(diào)LncRNA NORAD可促進(jìn)體外胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的存活、增殖［3］，還可通過促使血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）功能重塑、生長和遷移而引發(fā)主動脈夾層，且LncRNA NORAD在顱內(nèi)動脈瘤中過表達(dá)并參與其形成和破裂，沉默NORAD可抑制VSMC增殖和遷移［4-5］，因而LncRNA NORAD能作為潛在的顱內(nèi)動脈瘤治療靶點。miR-513b-5p是一種具有抑癌作用的微小RNA分子，可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［6］，在顱內(nèi)動脈瘤病人血清中水平顯著降低，過表達(dá)miR-513b-5p可抑制炎性因子誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其凋亡［7］；GREM1可調(diào)控細(xì)胞存活和運(yùn)動、侵襲功能，其高表達(dá)與腸癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)，能通過促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲［8］，GREM1可作為微小RNA的靶標(biāo)參與介導(dǎo)顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病，下調(diào)GREM1可抑制VSMC的存活及增殖［9］，由此可知miR-513b-5p及GREM1可能成為顱內(nèi)動脈瘤分子治療的新靶點。通過查詢Starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p是LncRNA NORAD的靶點及靶向GREM1的靶標(biāo)，因而預(yù)測LncRNA NORAD可能通過miR-513b-5p/GREM1軸調(diào)節(jié)VSMC的增殖、遷移、侵襲和凋亡。本研究通過體外分離培養(yǎng)顱內(nèi)動脈瘤病人動脈瘤組織中VSMC，探討LncRNA NORAD通過miR-513b-5p/GREM1軸調(diào)節(jié)顱內(nèi)動脈瘤病人血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和凋亡的機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

收集本院顱內(nèi)動脈瘤病人行開顱夾閉術(shù)的動脈瘤組織及同期顳葉癲癇病人切除的顳葉皮層動脈血管組織各20例，病人知情同意并簽署知情同意書。0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶溶液（貨號PB180225）、含雙抗DMEM培養(yǎng)基（貨號PM150216A）、特級胎牛血清（貨號164210）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；0.1%草酸銨結(jié)晶紫染色液（貨號G1063）、細(xì)胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒（貨號CA1210）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（貨號R0010）、總RNA提取試劑（貨號R1100）、脂質(zhì)體2000（貨號YZ-11668）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源抗人Anti-Vimentin一抗（貨號ab193555）、兔源抗人Anti-Ki67一抗（貨號ab16667）、兔源抗人Anti-E-cadherin一抗（貨號ab76319）購自美國Abcam公司；Hoechst 33342染色液（貨號C1022）、兔源抗人Anti-N-cadherin一抗（貨號AF0243）、小鼠抗人Anti-Bax一抗（貨號AF0054）、免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Alexa Fluor 555（貨號P0190）、一步法反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（貨號D7277M）、兔源抗人Anti-Bcl-2一抗（貨號AF1213）、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 488（貨號P0176）、兔抗人Anti-GAPDH一抗（貨號AF1186）、偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗兔IgG二抗（貨號A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。酶標(biāo)儀（型號MODEL680）購自美國Bio-Rad公司；四激發(fā)倒置熒光顯微鏡（型號YKY-1000）購自上海永科光學(xué)儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀（型號Prism7000）購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；蛋白電泳儀（型號PowerPac）、凝膠顯示系統(tǒng)（型號Gel Doc XR＋）購自美國BD公司等。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR法檢測人顱內(nèi)動脈瘤組織和正常組織中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表達(dá)

取出收集的動脈瘤組織及顳葉皮層動脈血管組織（經(jīng)病理檢查為正常動脈組織），剪碎后分別加入總RNA提取試劑研磨提取其中總RNA，每組取適量RNA采用一步法反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR試劑盒檢測其中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)，LncRNA NORAD、GREM1內(nèi)參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），miR-513b-5p內(nèi)參選用U6，所得各組基因Ct值采用2－△△Ct算法分析，最終得到各基因相對表達(dá)，引物序列見表1。

1.2.2細(xì)胞分離培養(yǎng)、分組處理及標(biāo)本收集

收集的新鮮顱內(nèi)動脈瘤組織，使用外科剪剪下適量并剪成約1 cm3左右的組織塊，加入胰酶消化至出現(xiàn)白色絮狀物，取出組織塊加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)組織塊黏附在瓶底后翻轉(zhuǎn)平放培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，可見細(xì)胞爬出生長，組織塊周圍細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時去除組織塊并傳代培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞多數(shù)伸展呈長梭形，有分枝狀突起，密度低時交織成網(wǎng)狀，密度高時為旋渦狀或柵欄狀，取第3代VSMC用于實驗。

VSMC傳代后接種在24孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分為對照組、LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組、共轉(zhuǎn)染組、共轉(zhuǎn)染陰性對照組，除對照組外其余各組使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LncRNA NORAD siRNA組轉(zhuǎn)染LncRNA NORAD siRNA，miR-513b-5p mimics組轉(zhuǎn)染miR-513b-5p mimics，共轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染LncRNA NORAD siRNA和miR-513b-5p inhibitor，共轉(zhuǎn)染陰性對照組轉(zhuǎn)染LncRNA NORAD siRNA陰性對照和miR-513b-5p inhibitor陰性對照，轉(zhuǎn)染24 h后分別收集各組細(xì)胞作為標(biāo)本備用。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表達(dá)

取各組細(xì)胞提取出RNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，量化各組細(xì)胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)。

1.2.4CCK-8法和免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖

VSMC傳代后以每孔5×104個的密度接種在96孔板培養(yǎng)，按照1.2.2中方法分組轉(zhuǎn)染后每孔加入CCK-8試劑15 μL孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值后計算各組增殖率，增殖率（%）＝實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，按照1.2.2中方法分組轉(zhuǎn)染后洗滌、固定細(xì)胞，封閉后孵育兔源抗人Anti-Ki67一抗，洗滌后孵育Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔二抗并采用Hoechst 33342染色細(xì)胞核，采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞并采集圖像，計算各組細(xì)胞Ki67陽性率，細(xì)胞Ki67陽性率＝Ki67陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5Hoechst 33342染色和免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡

VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，按照1.2.2中方法分組轉(zhuǎn)染后洗滌、固定細(xì)胞，封閉后孵育Hoechst 33342染色液后于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞并采集圖像，計算各組細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞（核固縮呈明亮藍(lán)色）數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，按照1.2.2中方法分組轉(zhuǎn)染后洗滌、固定細(xì)胞，封閉后孵育兔源小鼠抗人Anti-Bax一抗和兔源抗人Anti-Bcl-2一抗，洗滌后孵育Alexa Fluor 555偶聯(lián)的抗小鼠二抗和Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔二抗，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞并采集圖像，運(yùn)用Image J軟件分析并定量圖像中紅色和綠色熒光強(qiáng)度，計算各組細(xì)胞Bax/Bcl-2＝紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度。

1.2.6細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移侵襲

VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，按照1.2.2中方法分組轉(zhuǎn)染后使用移液器槍頭在每孔中央畫一條直線，并洗去劃痕中的細(xì)胞后于顯微鏡下觀察拍照，運(yùn)用Image J軟件分析并定量圖像中劃痕寬度，記為L0 h，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后再次拍照后定量劃痕寬度，記為L24 h，計算各組細(xì)胞遷移率＝（L0 h－L24 h）/L0 h×100%。

收集的各組細(xì)胞取出后分別加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后，以每孔5×105個的密度接種在Transwell培養(yǎng)板的上室（Matrigel包被過夜），同時在其下室加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室并擦去上層細(xì)胞，洗滌、固定下層細(xì)胞后孵育0.1%草酸銨結(jié)晶紫染色液，于顯微鏡下觀察各組細(xì)胞并采集圖像，運(yùn)用Image J軟件分析并定量圖像中細(xì)胞數(shù)。

1.2.7免疫印記實驗檢測細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)

取1.2.2中各組細(xì)胞，采用高效RIPA裂解液提取出其中總蛋白，以BCA法測定其濃度后每組取20 μg煮沸變性，上樣進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，封閉后剪下神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、E-鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH蛋白，孵育相應(yīng)一抗和二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，洗膜后顯色各組蛋白并采集圖像，運(yùn)用Image J軟件定量各蛋白灰度后量化其相對表達(dá)。

1.2.8檢測VSMC中LncRNA NORAD對miR-513b-5p、miR-513b-5p對GREM1的靶向調(diào)控

VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分為野生miR-513b-5p＋空載組（轉(zhuǎn)染野生型miR-513b-5p和空載質(zhì)粒）、野生miR-513b-5p＋LncRNA NORAD過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染野生型miR-513b-5p和LncRNA NORAD過表達(dá)質(zhì)粒）、突變miR-513b-5p＋空載組（轉(zhuǎn)染突變型miR-513b-5p和空載質(zhì)粒）、突變miR-513b-5p＋LncRNA NORAD過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染突變型miR-513b-5p和LncRNA NORAD過表達(dá)質(zhì)粒），采用脂質(zhì)體2000按照上述分組做轉(zhuǎn)染，24 h后收集各組細(xì)胞并采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定其雙熒光素酶相對活性。VSMC傳代后以每孔5×105個的密度接種在24孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分為野生GREM1＋miR-513b-5p mimics陰性對照組（轉(zhuǎn)染野生型GREM1 3′-UTR報告質(zhì)粒和miR-513b-5p mimics陰性對照）、野生GREM1＋LncRNA NORAD過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染野生型GREM1 3′-UTR報告質(zhì)粒和miR-513b-5p mimics）、突變GREM1＋miR-513b-5p mimics陰性對照組（轉(zhuǎn)染突變型GREM1 3′-UTR報告質(zhì)粒和miR-513b-5p mimics陰性對照）、突變GREM1＋LncRNA NORAD過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染突變型GREM1 3′-UTR報告質(zhì)粒和miR-513b-5p mimics），采用脂質(zhì)體2000按照上述分組做轉(zhuǎn)染，24 h后測定各組細(xì)胞雙熒光素酶相對活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間進(jìn)一步差異比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1顱內(nèi)動脈瘤與正常組織LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)比較

與正常組織比較，顱內(nèi)動脈瘤組織LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.2各組細(xì)胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)比較

與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組細(xì)胞LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)升高（P＜0.05）；miR-513b-5p mimics組細(xì)胞LncRNA NORAD表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），GREM1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），miR-513b-5p表達(dá)升高（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞LncRNA NORAD表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-513b-5p表達(dá)降低（P＜0.05），GREM1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.3各組細(xì)胞增殖情況比較

與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組細(xì)胞增殖率、Ki67陽性率降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞增殖率、Ki67陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率、Ki67陽性率升高（P＜0.05）。詳見圖1、表4。

2.4各組細(xì)胞凋亡情況

與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2升高（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組凋亡率、Bax/Bcl-2差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2降低（P＜0.05）。 詳見圖2、圖3及表5。

2.5各組細(xì)胞侵襲、遷移情況

與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組細(xì)胞遷移率及侵襲數(shù)降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞遷移率及侵襲數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率及侵襲數(shù)升高（P＜0.05）。詳見圖4、圖5及表6。

2.6各組細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin表達(dá)水平比較

與對照組比較，LncRNA NORAD siRNA組、miR-513b-5p mimics組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LncRNA NORAD siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見圖6及表7。

2.7LncRNA NORAD對血管平滑肌細(xì)胞miR-513b-5p、miR-513b-5p對GREM1的靶向調(diào)節(jié)

查詢Starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)LncRNA NORAD與miR-513b-5p之間存在結(jié)合位點（見圖7）。與野生miR-513b-5p＋空載組比較，野生miR-513b-5p＋LncRNA NORAD過表達(dá)組相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變miR-513b-5p＋空載組與突變miR-513b-5p＋LncRNA NORAD過表達(dá)組間相對熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表8。

查詢Starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p與GREM1之間存在結(jié)合位點（見圖8）。與野生GREM1＋miR-513b-5p mimics陰性對照組比較，野生GREM1＋miR-513b-5p mimics組相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變GREM1＋miR-513b-5p mimics陰性對照組與突變GREM1＋miR-513b-5p mimics組相對熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表9。

3討論

目前，我國顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病率逐年提升，因動脈瘤破裂導(dǎo)致的腦出血病例隨之增多，可造成很多病人殘疾、死亡，至今尚未發(fā)現(xiàn)特別有效的治療藥物，因此，探究顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，進(jìn)而進(jìn)行防治具有重大臨床意義［10-11］。LncRNA NORAD作為一種致癌因子，可調(diào)控細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化、遷移及侵襲過程，可通過增強(qiáng)胃癌細(xì)胞活力和EMT來促使其增殖、遷移、侵襲［12］，敲除NORAD能顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［13］，還可通過調(diào)控VSMC存活、增殖、凋亡及遷移侵襲而介導(dǎo)主動脈夾層和顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展，敲除NORAD可通過抑制VSMC的增殖、遷移和糖酵解來治療主動脈夾層， 可能是緩解顱內(nèi)動脈瘤形成和發(fā)展的有效手段［4-5］。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NORAD在顱內(nèi)動脈瘤組織中明顯高表達(dá)，且以LncRNA NORAD siRNA沉默LncRNANORAD可降低VSMC增殖率、Ki67陽性率、遷移率、侵襲數(shù)及N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，升高其凋亡率、Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)，表明LncRNA NORAD參與介導(dǎo)顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生，對其進(jìn)行敲除可減弱VSMC活力和EMT，抑制其增殖及遷移侵襲，并促使其凋亡，揭示沉默LncRNA NORAD是有前景的顱內(nèi)動脈瘤防治策略。

有研究顯示LncRNA NORAD是miR-496、miR-451等微小RNA的上樣靶標(biāo)，可通過靶向下調(diào)其表達(dá)來介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖及遷移侵襲過程［12-13］，miR-513b-5p作為一種抑癌RNA分子可調(diào)控包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的等多種腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡［14］，上調(diào)miR-513b-5p可降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力［15］，并在體外抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并誘導(dǎo)其凋亡［16］，且研究顯示miR-513b-5p在顱內(nèi)動脈瘤病人體內(nèi)明顯低表達(dá)，增強(qiáng)miR-513b-5p表達(dá)可促使炎性因子誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細(xì)胞死亡，降低其存活率［7］；GREM1是調(diào)控腫瘤發(fā)生、血管生成和EMT過程的重要因子［17］，可誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞EMT，并促進(jìn)其遷移和血管生成［18］，在顱內(nèi)動脈瘤組織中表達(dá)明顯升高，對其下調(diào)可抑制人臍動脈VSMC的增殖能力并誘導(dǎo)其凋亡［19］，查詢Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-513b-5p與LncRNA NORAD及GREM1之間存在結(jié)合位點，由此可推測miR-513b-5p/GREM1可能是LncRNA NORAD調(diào)控VSMC的增殖、遷移侵襲和凋亡的分子靶點。本研究顯示，miR-513b-5p在顱內(nèi)動脈瘤組織中表達(dá)明顯降低，GREM1表達(dá)明顯升高，以miR-513b-5p mimics上調(diào)miR-513b-5p表達(dá)，可促使VSMC增殖、遷移及侵襲，具有與沉默LncRNA NORAD相似的功效，且雙熒光素酶報告分析實驗證實LncRNA NORAD可靶向下調(diào)miR-513b-5p表達(dá)，而miR-513b-5p可靶向下調(diào)GREM1表達(dá)，由此證實LncRNA NORAD可通過靶向下調(diào)miR-513b-5p而增強(qiáng)GREM1表達(dá)，進(jìn)而促使顱內(nèi)動脈瘤形成。以LncRNA NORAD siRNA和miR-513b-5p inhibitor聯(lián)合處理VSMC，較LncRNA NORAD siRNA單獨處理，可升高細(xì)胞GREM1 mRNA表達(dá)、增殖率、Ki67陽性率、遷移率、侵襲數(shù)及N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，降低miR-513b-5p表達(dá)、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)，表明下調(diào)miR-513b-5p可減弱沉默LncRNA NORAD對VSMC增殖、EMT、遷移侵襲的抑制，并降低其促凋亡功能，揭示沉默LncRNA NORAD抑制VSMC增殖、EMT、遷移侵襲是通過上調(diào)miR-513b-5p表達(dá)實現(xiàn)的。

總之，LncRNA NORAD可通過靶向下調(diào)miR-513b-5p而增強(qiáng)GREM1表達(dá)，進(jìn)而參與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病過程，敲除LncRNA NORAD通過促使miR-513b-5p表達(dá)而降低GREM1表達(dá)，進(jìn)而減弱VSMC的增殖、EMT、遷移侵襲，增強(qiáng)其凋亡。

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（收稿日期：2022-09-13）

（本文編輯郭懷?。?/p>