鐘繼紅 劉勇攀 陳丹丹 黃秋薇 張馨瑞 徐勤科 葉露

[摘要]?目的?研究雷公藤多苷（tripterygium?glycosides，TG）對葡聚糖硫酸鈉（dextran?sodium?sulfate，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎（ulcerative?colitis，UC）小鼠結腸黏膜損傷的影響及調(diào)控機制。方法?將40只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組，模型組，雷公藤多苷低、中、高劑量組（給藥濃度分別為9.00、27.03、81.09mg/kg）。除正常組外，其余組小鼠均飲用5%?DSS誘導UC模型。造模后，模型組小鼠予生理鹽水灌胃，其余處理組小鼠予相應劑量的TG灌胃。比較各組小鼠的質(zhì)量、疾病活動指數(shù)（disease?activity?index，DAI）、結腸病理組織學損傷情況。使用腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）試劑盒檢測TNF-α、MDA、SOD水平差異。Western?blot法檢測結腸中Nur77、TNF受體關聯(lián)因子2（tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factor?2，Traf2）、核孔蛋白62（nucleoporin?62，P62）、自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（autophagy?protein-microtubule?associated?protein1?light?chain?3，LC3）分子表達。結果?與空白組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量、結腸長度、SOD、Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低（P<0.05），DAI、結腸病理評分、TNF-α、MDA、P62水平升高（P<0.05）。與模型組相比，雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠體質(zhì)量、結腸長度、SOD、Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達增長（P<0.05），DAI、TNF-α、MDA、P62水平均降低（P<0.05）。雷公藤多苷中、高劑量組小鼠病理評分降低（P<0.05）。結論?TG能夠通過Nur77-Traf2-P62信號通路治療UC。

[關鍵詞]?雷公藤多苷；潰瘍性結腸炎；Nur77-Traf2-P62信號通路；自噬

[中圖分類號]?R574??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.014

Mechanistic?study?of?tripterygium?glycosides?in?the?treatment?of?ulcerative?colitis?through?the?Nur77-Traf2-P62?signaling?pathway

ZHONG?Jihong1，?LIU?Yongpan1，?CHEN?Dandan2，?HUANG?Qiuwei2，?ZHANG?Xinrui2，?XU?Qinke2，?YE?Lu2

1.Department?of?Gastroenterology，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310005，?Zhejiang，?China;?2.the?Second?Clinical?Medical?College，?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310053，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigated?the?effect?of?tripterygium?glycosides?（TG）?on?dextran?sodium?sulfate?（DSS）-induced?colonic?mucosal?damage?in?ulcerative?colitis?（UC）?mice?and?its?regulatory?mechanism.?Methods?Forty?C57BL/6J?mice?were?randomly?divided?into?a?normal?group，?a?model?group，?and?a?tretinoin?low，?medium，?and?high?dose?group?（administered?at?concentrations?of?9.00mg/kg，?27.03mg/kg，?and?81.09mg/kg，?respectively）.?The?mice?in?the?normal?group?were?free?to?drink?distilled?water，?and?the?rest?of?the?mice?drank?5%?DSS?to?induce?UC?modeling.?After?modeling，?mice?in?the?model?group?were?given?0.4ml?of?saline?by?gavage?daily，?and?the?rest?of?the?mice?in?the?treatment?group?were?given?the?corresponding?dose?of?TG?for?gavage?intervention.?The?mass?and?disease?activity?index?of?the?mice?in?each?group?were?compared，?and?the?pathological?and?histological?damage?of?the?colon?was?observed.?Tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?malondialdehyde?（MDA），?and?superoxide?dismutase?（SOD）?levels?were?measured?using?the?corresponding?kits.?Western?blot?Detection?of?Nur77，?tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factor?2?（Traf2），?nucleoporin?62?（P62），?autophagy?protein-microtubule?associated?protein1?light?chain?3?（LC3）?molecular?expression.?Results?Compared?with?the?blank?group，?the?body?weight，?colon?length，?SOD，?Nur77，?Traf2，?and?LC3II/LC3Ⅰ?levels?of?mice?in?the?model?group?were?significantly?decreased?（P<0.05），?and?the?DAI?level，?colon?pathology?score，?TNF-α，?MDA?level，?and?P62?of?the?mice?were?significantly?increased?（P<0.05）.?Compared?with?mice?in?the?UC?model?group，?mice?in?the?low，?medium?and?high?dose?groups?of?tretinoin?polyphenols?showed?significant?increases?in?body?weight，?colon?length，?SOD，?Nur77，?Traf2，?LC3II/LC3Ⅰlevels?（P<0.05），?and?mice?with?DAI?scores，?TNF-α，?MDA?levels?in?the?colon，?and?P62?levels?were?significantly?decreased?（P<0.05）.?Mice?in?the?medium?and?high?dose?groups?of?tretinoin?polyphenols?pathological?scores?were?significantly?reduced?（P<0.05）.?Conclusion?TG?is?able?to?treat?ulcerative?colitis?through?Nur77-Traf2-P62?signaling?pathway.

[Key?words]?Tripterygium?glycosides;?Ulcerative?colitis;?Nur77-Traf2-P62?signaling?pathway;?Autophagy

潰瘍性結腸炎（ulcerative?colitis，UC）是一種免疫介導的大腸慢性、炎癥性疾病，其患病率和發(fā)病率逐年升高。UC不僅可以出現(xiàn)腹痛、黏液膿血便等癥狀，長期發(fā)展可引起發(fā)育不良或者結直腸癌[1]。此外，該病患者可能合并焦慮等心理疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及長期發(fā)展[2]。遺傳易感性、上皮屏障破壞和腸道菌群失調(diào)會引發(fā)免疫反應失調(diào)和異常炎癥信號，導致UC的發(fā)生。但是目前UC的發(fā)病原因及機制仍不明確，深入探索UC的確切發(fā)病機制和尋找有效的治療藥物是迫切需要解決的問題。研究表明，線粒體功能缺陷在UC發(fā)病中起到重要作用，炎癥性腸病患者的結腸中的線粒體形態(tài)改變、膜電位降低、活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）產(chǎn)生增加，線粒體自噬機制遭到破壞[3-4]。雷公藤是衛(wèi)矛科植物雷公藤的根莖，具有祛風除濕、通絡止痛、解毒殺蟲等功效[5]。雷公藤多苷（tripterygium?glycosides，TG）提取自草藥雷公藤中，主要成分為雷公藤紅素和雷公藤甲素，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗感染等藥理作用[6]。在臨床中，TG常用于類風濕性關節(jié)炎等免疫疾病的治療。相關藥理研究發(fā)現(xiàn)，TG可在多種疾病中發(fā)揮抗炎及調(diào)節(jié)自噬作用[7-9]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可通過Nur77與TNF受體關聯(lián)因子2（tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factor?2，Traf2）相互作用的方式誘導線粒體自噬，進而抑制炎癥[10]。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran?sodium?sulfate，DSS）構造UC動物模型，觀察TG對UC小鼠及Nur77、Traf2、核孔蛋白62（nucleoporin?62，P62）的影響，探尋其治療UC的可能作用機制，為UC患者的治療提供一個新的治療靶點。

1??材料與方法

1.1??實驗動物

6～8周齡的SPF級C57BL/6J小鼠40只，體質(zhì)量20～24g，購自上海斯萊克動物實驗有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0004]。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物中心[實驗動物使用許可證號SYXY（浙）2021-0012]。本研究得到浙江中醫(yī)藥大學動物保護與倫理委員會批準（倫理審批號：20210726-08）。

1.2??主要材料

DSS購自美國MP公司；雷公藤多苷片購自浙江得恩德制藥有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于上海梵凱實業(yè)有限公司；組織細胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、組織細胞超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法）購自北京普利萊公司；Nur77多克隆抗體、P62多克隆抗體、Traf2多克隆抗體購自美國ImmunoWay公司；β-肌動蛋白兔單克隆抗體、山羊抗兔辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標記二抗購自浙江達文有限公司；自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（autophagy?Protein-?microtubule?associated?protein1?light?chain?3，LC3）多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3??動物實驗分組及模型制備

40只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為5組（8只/組）。除正常組小鼠外，其余小鼠均自由飲用7d?5%DSS誘導UC模型。造模后，模型組小鼠每日予0.4ml生理鹽水灌胃；低、中、高劑量組小鼠分別予9.00mg/kg、27.03mg/kg、81.09mg/kg濃度的雷公藤多苷混懸液0.4ml灌胃。共灌胃7d，每天觀察小鼠的體質(zhì)量變化和疾病活動指數(shù)（disease?activity?index，DAI）。

1.4??HE染色觀察結腸病理學改變

將小鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛組織固定液24h，取病變最明顯處，將其包埋、切片、HE染色后，置于光鏡下觀察組織結構及形態(tài)改變。

1.5??檢測方法

取凍存的小鼠結腸組織，按照試劑盒的說明書進行操作，檢測結腸組織中TNF-α、SOD、MDA的含量。將凍存的結腸組織進行裂解，取上清液為總蛋白，采用BCA定量后進行Western?blot法檢測。使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，100V電壓，電泳2h。電泳結束后，在300mA電流下轉模1h并使用5%?BSA封閉2h。然后將膜取出，使用TBST漂洗后，分別置于β-actin、Nur77、P62、Traf2、LC3一抗中4℃孵育過夜。隔日回收一抗，將膜再次使用TBST漂洗，然后加入二抗在室溫下孵育1h，再次洗膜后滴加ECL顯影液進行壓片顯影。以β-actin為內(nèi)參，采用Image?J軟件對圖像中條帶的灰度值進行相對定量計算。

1.6??統(tǒng)計學方法

采用SPSS?26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，且多組間方差齊則采用方差分析，組間比較采用LSD-t法分析，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示。采用Kruskal-Wallis?H檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結果

2.1??小鼠結腸長度、體質(zhì)量、DAI評分及病理學評分

實驗期間，正常組小鼠精神狀態(tài)正常，毛色光澤，糞便正常，體質(zhì)量呈自然上升趨勢。模型組小鼠精神狀態(tài)萎靡，毛色及眼神暗淡，糞便呈血稀便，體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢。TG干預的三組小鼠的癥狀較模型組小鼠改善，以雷公藤多苷高劑量組小鼠改善最明顯。

實驗結束后，與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低，DAI評分顯著升高，病理學評分顯著上升，結腸長度明顯減短，差異均有統(tǒng)計意義（P<0.05）。與模型組小鼠比較，雷公藤多苷給藥后小鼠結腸均增長，體質(zhì)量增加，DAI評分降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TG給藥后小鼠結腸病理評分均下降，其中雷公藤多苷中、高劑量組小鼠與模型組比具有顯著差異（P<0.05）。

2.2??各組小鼠TNF-α、SOD、MDA含量

實驗結束后，與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中TNF-α、MDA含量顯著增加，SOD含量顯著下降。與模型組小鼠相比，TG給藥后小鼠結腸中TNF-α、MDA含量顯著降低，TG給藥后小鼠結腸中SOD含量均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3??小鼠通路相關蛋白及自噬蛋白表達情況

實驗結束后，與正常組相比，模型組小鼠結腸組織中Nur77、Traf2蛋白表達水平顯著降低，P62蛋白表達水平顯著上升；此外LC3Ⅱ/LC3Ⅰ自噬蛋白水平顯著降低（P<0.05）。與模型組小鼠相比，TG給藥后小鼠結腸中Nur77、Traf2蛋白水平均顯著上調(diào)，中、高劑量組小鼠結腸中P62蛋白水平下調(diào)，此外所有給藥小鼠結腸中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ自噬蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05）。

3??討論

UC是一種與潰瘍形成和復發(fā)性炎癥相關的結腸炎癥性疾病，它發(fā)病的確切機制仍然不清楚。目前，臨床上治療UC的藥物，主要有糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸制劑和生物抑制劑。但是由于其誘發(fā)的嚴重不良反應和低臨床應答率，臨床上迫切需要開發(fā)一種療效更好、不良反應更小的新治療策略來治療UC。盡管UC的發(fā)病原因尚不明確，但是目前認為線粒體功能缺陷在UC發(fā)病中起到重要作用。線粒體是細胞內(nèi)重要的供能細胞器，同時可產(chǎn)生ROS從而調(diào)節(jié)氧化還原信號傳導通路。研究表明，UC發(fā)病過程中炎癥小體激活與線粒體源ROS密切相關[11-12]。線粒體源ROS在炎癥反應中作為重要介質(zhì)發(fā)揮驅(qū)動炎癥反應的作用。MDA是ROS誘導的脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，可引發(fā)細胞代謝和功能障礙，導致細胞死亡，而SOD等抗氧化酶可以預防ROS對組織造成損傷[13-14]。促炎細胞因子和氧化應激的過度產(chǎn)生是UC發(fā)病過程中結腸損傷的重要標志物[15]。在線粒體受損后，ROS的過度產(chǎn)生進一步促進促炎細胞因子釋放，放大免疫信號并破壞腸黏膜屏障[16-18]。因此，線粒體受損后的功能異常與UC的發(fā)病密切相關。本研究DSS誘導的UC小鼠模型中，小鼠體質(zhì)量下降，DAI評分增高，結腸長度縮短，結腸中TNF-α、MDA含量升高，SOD含量下降。經(jīng)TG干預后，小鼠體質(zhì)量上升，DAI評分降低，結腸長度變長，結腸中TNF-α、MDA含量降低，SOD含量顯著上調(diào)。結果表明，TG可減輕DSS誘導的結腸炎癥，并減少UC小鼠促炎細胞因子的產(chǎn)生和氧化應激，其機制可能與線粒體自噬有關。

Nur77是一種核受體轉錄因子，在肝炎、炎癥性腸病等炎癥性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著核心作用。近年來發(fā)現(xiàn)的Nur77-Traf2-P62通路是一條參與炎癥反應和細胞自噬的信號通路，該通路參與多種疾病的病理生理過程，包括炎癥和腫瘤，激活該通路可有助于促進自噬并抑制炎癥反應[10，19]。Bauer等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nur77在DSS誘導的UC模型中是腸道炎癥產(chǎn)生的關鍵，因此Nur77可成為治療UC的潛在靶點。Zhang等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，Nur77從細胞核轉運至細胞質(zhì)，轉而并定位于線粒體，從而誘導細胞凋亡。當Nur77從核內(nèi)轉運到線粒體上時，會與Traf2相互作用。Traf2是一種重要的炎癥信號通路支架蛋白和關鍵的泛素連接酶。在炎癥狀態(tài)下，泛素化的Nur77在線粒體上與P62泛素結合域相互作用，從而增強線粒體自噬的敏感性。在細胞自噬過程中，自噬發(fā)生的核心蛋白LC3與修飾后的Nur77發(fā)生特異的相互作用，確保受損線粒體的選擇性清除，細胞將受損的線粒體包裹成自噬小體，并將其輸送到溶酶體中完成自噬過程。本研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導的UC小鼠模型中，小鼠結腸中Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達降低，P62表達上升。經(jīng)TG干預后，小鼠結腸中Nur77、Traf2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達上調(diào)，P62表達降低。實驗結果表明TG可通過激活Nur77-Traf2-P62信號通路緩解DSS誘導的結腸炎癥，而這一過程可能與線粒體自噬有關。

綜上所述，TG可以改善DSS誘導的UC小鼠的結腸炎癥及氧化應激，其機制可能與激活Nur77-Traf2-P62通路促進自噬有關。本研究從自噬角度初步解釋了TG改善UC的作用機制，為臨床治療UC提供了一定依據(jù)，但仍需開展深入的分析研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–06–16）

（修回日期：2024–02–18）