劉煉++張麗芳++方志南+++王曦?zé)?/p>

[摘要] 目的 探討柴胡皂苷對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、自噬及凋亡的影響。 方法 將SKOV3細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞）、低劑量組（SKOV3細(xì)胞+10 μmol/L柴胡皂苷）和高劑量組（SKOV3細(xì)胞+20 μmol/L柴胡皂苷）進(jìn)行培養(yǎng)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達(dá)情況。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組可抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡（P < 0.05）；柴胡皂苷干預(yù)治療SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值升高，Caspase-3表達(dá)增多（P < 0.05）；柴胡皂苷可使SKOV3細(xì)胞中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，Beclin-l表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 柴胡皂苷可通過(guò)增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞自噬強(qiáng)度，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

[關(guān)鍵詞] 柴胡皂苷；卵巢癌；SKOV3細(xì)胞；自噬；凋亡

[中圖分類號(hào)] R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（b）-0025-04

Study on the apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells induced by saikosaponin

LIU Lian1 ZHANG Lifang1 FANG Zhinan1 WANG Xiye2

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Hubei Space Hospital， Hubei Province， Xiaogan 432100， China； 2.Key Laboratory of Natural Product Chemistry and Functional Molecular Synthetic Autonomous Region， Inner Mongolia University for the Nationalities， Inner Mongolia Autonomous Region， Tongliao 028000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of saikosaponin on proliferation， autophagy and apoptosis in ovarian cancer SKOV3 cells. Methods The SKOV3 cells were divided into control group （normal cultured SKOV3 cells）， low dose group （SKOV3 cells+10 μmol/L saikosaponin） and high dose group （SKOV3 cells + 20 μmol/L saikosaponin） and cultured. The proliferation of cells in each group was detected by four methyl AZO （MTT） method at 24， 48， 72 h； the apoptosis of cells was measured by flow cytometry； the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 were detected by ELISA method； the expression of LC3-Ⅰ， LC3-Ⅱ and Beclin-l were analyzed by Western blot method. Results Compared with the control group， the proliferation of SKOV3 cells were decreased and the apoptosis rate of SKOV3 cells were promoted in the low dose group and high dose group （P < 0.05）. After intervention of SKOV3 cells with saikosaponin， the Bax/Bcl-2 ratio were increased and the expression of Caspase-3 were also increased （P < 0.05）； the LC3-I/LC3-II ratio were decreased， the expression of Beclin-l were increased， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Saikosaponin can inhibit the growth of SKOV3 cells， enhance the autophagy intensity of ovarian cancer cells and lead to cell apoptosis.

[Key words] Saikosaponin； Ovarian cancer； SKOV3 cells； Autophagy； Apoptosis

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性疾病，占婦科癌癥的20%，5年生存率僅為30%，死亡率較高[1]。卵巢癌臨床癥狀多表現(xiàn)為絕經(jīng)后陰道出血，目前多以手術(shù)、化療治療為主，但效果并不理想；因此，尋找治療卵巢癌的有效藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。有研究表明，中藥柴胡中的有效成分柴胡皂苷可干擾腫瘤細(xì)胞S期DNA合成及蛋白質(zhì)代謝的作用，明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2]。本團(tuán)隊(duì)提出柴胡皂苷可能通過(guò)影響卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白，從打破卵巢癌細(xì)胞凋亡/抗凋亡平衡，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞增殖的科學(xué)假說(shuō)；并應(yīng)用不同濃度的柴胡皂苷干預(yù)卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，觀察自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l的表達(dá)及對(duì)凋亡的影響，為使用中藥提取物柴胡皂苷治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①柴胡皂苷（內(nèi)蒙古民族大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；②SKOV3細(xì)胞（ATCC公司，美國(guó)）；③光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）；④一氧化氮檢測(cè)儀（NO-501，IMN，日本）；⑤水平搖床（WD-9405B，六一公司，北京）；⑥anti-LC3-Ⅰ、anti-LC3-Ⅱ、anti-Beclin-l、GAPDH內(nèi)參抗體（ABCAM公司）；⑦Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒（SIGMA，美國(guó)）；⑧Bcl-2、Bax和Caspase-3 ELISA試劑盒（SIGMA，美國(guó)）；⑨RPMI 1640（GIBCO，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將SKOV3細(xì)胞加入到10%滅活小牛血清的MEM培養(yǎng)液中，于37℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，每2～3天傳代1次，待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，經(jīng)過(guò)0.25%胰酶消化后，過(guò)濾成單細(xì)胞懸濁液[3]。將細(xì)胞懸濁液以5×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)5×103個(gè)。將細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞）、低劑量組（SKOV3細(xì)胞+10 μmol/L柴胡皂苷培養(yǎng)30 min）和高劑量組（SKOV3細(xì)胞+20 μmol/L柴胡皂苷培養(yǎng)30 min）。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞增殖率

實(shí)驗(yàn)前用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確認(rèn)SKOV3細(xì)胞拒染率在95%以上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×107/L，取200 μL接種于96孔板中（每組細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔），設(shè)對(duì)照組、空白載體組、實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清，逐一加入DMSO 100 μL后震蕩混勻，待藍(lán)色晶體完全溶解反應(yīng)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處的吸光度值（OD值）[4]。抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.3.2細(xì)胞凋亡率

分別收集72 h培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)消化、PBS沖洗、懸浮、300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞后加入300 μL Binding Buffer懸濁細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混合，再加入10 μL Propidium Iodide并充分混勻；常溫下避光反應(yīng)20 min；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并應(yīng)用軟件分析結(jié)果[5]。

1.3.3 Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作[6]，具體步驟如下：①配制標(biāo)準(zhǔn)品液；②計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線；③加樣；④洗板；⑤孵育；⑥洗板；⑦暗反應(yīng)；⑧計(jì)算OD值；⑨計(jì)算結(jié)果。

1.3.4 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達(dá)

Western blot檢測(cè)步驟：①蛋白質(zhì)抽提；②蛋白質(zhì)定量；③SDS-PAGE；④轉(zhuǎn)印至PVDF膜；⑤封閉；⑥孵育一抗；⑦孵育二抗；⑧ECL底物發(fā)光；⑨圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l的表達(dá)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SKOV3細(xì)胞增殖情況

與對(duì)照組比較，低、高劑量組均對(duì)SKOV3細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)作用（P < 0.05）；與低劑量組相比較，高劑量組對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率更高（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組SKOV3細(xì)胞凋亡情況

與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（2.98±0.31）%相比，低劑量組細(xì)胞凋亡率（5.21±0.31）%明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而與低劑量組比較，高劑量組細(xì)胞凋亡率（29.74±3.21）%增加明顯（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 各組SKOV3細(xì)胞中Bax、Bcl-2及Caspase-3表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，低、高劑量組Bax/Bcl-2值及Caspase-3表達(dá)水平均升高（P < 0.05）；與低劑量組相比，高劑量組Bax/Bcl-2值及Caspase-3表達(dá)水平更高（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組SKOV3細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)后，低、高劑量組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且低劑量組比值較高劑量組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與對(duì)照組比較，低、高劑量組Beclin-1表達(dá)明顯增高，且高劑量組比低劑量組表達(dá)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

3 討論

因卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，預(yù)后極差，現(xiàn)階段手術(shù)治療效果欠佳，臨床治療多以化療為主[8]。但化療藥物毒副作用強(qiáng)、靶向性不明確、易產(chǎn)生耐藥性，在臨床應(yīng)用中受到諸多限制[9]。因此，尋找高效、靶向治療卵巢癌的方法不僅是目前的研究熱點(diǎn)，更是亟待解決的問(wèn)題。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效成分，研究證實(shí)柴胡皂苷具有抗病毒、抗過(guò)敏、抗炎、抗腫瘤和抑制細(xì)胞黏附等作用[10]?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為[11-12]，柴胡皂苷抗腫瘤作用可能是通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞游走、吞噬能力，抑制腫瘤細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。Lee等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷對(duì)胃癌、乳腺癌、肝癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用，其中對(duì)于胃癌細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)。但在目前還沒(méi)有柴胡皂苷治療卵巢癌的深入研究。

自噬是細(xì)胞自身保護(hù)的方法之一，具有動(dòng)態(tài)性和多面性等特征。對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，適度的自噬可通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)大分子為細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)提供能量；過(guò)度活化的自噬則導(dǎo)致細(xì)胞死亡的發(fā)生[14]。在細(xì)胞內(nèi)，LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，而后者又可與自噬體膜相結(jié)合，故LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ常被看作自噬的進(jìn)展程度[15]。

Beclin-l可與Vps34形成復(fù)合體，該復(fù)合體使磷脂酰肌醇磷酸化，產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇以引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的定位[16]。故Beclin-l也被看做自噬發(fā)生的重要因子。通常自噬與凋亡之間的關(guān)系大致分為3種：促進(jìn)、拮抗和合作[17]。自噬和凋亡協(xié)作引起細(xì)胞死亡，兩者可能同時(shí)發(fā)生；或者當(dāng)其中一個(gè)程序受到阻礙或抑制時(shí)，另一個(gè)程序被激活并繼續(xù)完成細(xì)胞死亡過(guò)程[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞增長(zhǎng)，且其抑制SKOV3細(xì)胞增殖；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率隨柴胡皂苷劑量增加而增加，說(shuō)明柴胡皂苷通過(guò)增加細(xì)胞凋亡而起到抑制卵巢癌細(xì)胞增長(zhǎng)的作用。為了深入探究柴胡皂苷對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的作用，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Bcl-2和Bax，及自噬相關(guān)因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-l的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)后Caspase-3表達(dá)升高、Bax/Bcl-2比值升高，說(shuō)明柴胡皂苷可打破卵巢癌細(xì)胞凋亡/抗凋亡平衡，并促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，這與步世忠[2]的研究結(jié)果相似。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)治療后，卵巢癌細(xì)胞中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值明顯降低，而B(niǎo)eclin-l的表達(dá)明顯升高。Beclin-l是一種重要的自噬調(diào)節(jié)因子，后被人們發(fā)現(xiàn)可與Bcl-2相互作用[19]，Beclin-1/Bcl-2是確定的自噬與凋亡的分子連接。當(dāng)Beclin-l表達(dá)水平升高時(shí)，可將促凋亡蛋白BAK/BAX從與Bcl-2的結(jié)合中釋放出來(lái)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]，這可能是柴胡皂苷促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬、凋亡的原因之一。

因此，柴胡皂苷對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)自噬與凋亡相關(guān)因子表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但柴胡皂苷是單純通過(guò)影響自噬相關(guān)因子進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還是同時(shí)影響SKOV3細(xì)胞自噬及凋亡需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉文彬，閆海山，牛紅衛(wèi).紫杉醇聯(lián)合順鉑治療晚期卵巢癌的臨床療效觀察[J].腫瘤藥學(xué)，2012，2（3）：220-222.

[2] 步世忠，許金康，孫繼虎，等.柴胡皂甙d上調(diào)人急性早幼粒白血病細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體mRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20（5）：350.

[3] 魏彩，秦宜德，鄭欣，等.乳源免疫調(diào)節(jié)肽體外抑制人卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（1）：42-48.

[4] 徐國(guó)才，張莘，相媛媛，等.雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3凋亡和自噬的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013， 32（4）：446-449.

[5] 黃亮，唐正嚴(yán)，李東杰，等.氯胺酮誘導(dǎo)人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014， 39（7）：703-707.

[6] 王伊林，單曉彤，柴花，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉腹腔注射對(duì)阿霉素心肌病大鼠心功能及左室纖維化的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56（7）：34-36.

[7] 王伊林，趙雅君，楊洋，等.磷酸肌酸鈉對(duì)慢病毒介導(dǎo)Calumenin蛋白沉默阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的作用[J].臨床心血管病雜志，2015，31（10）：1119-1122.

[8] 劉曼，胡明英，王曉莉，等. AKT基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及Fas、FasL、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56（7）：29-31.

[9] 王伊林，崔曉雪，柴花，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)阿霉素心肌病大鼠心室肌閏盤(pán)保護(hù)作用[J].臨床心血管病雜志，2016，32（8）：843-847.

[10] 葉曉平，送純清.柴胡皂苷藥理研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，35（12）：1443-1436.

[11] 吳克勤.柴胡皂苷D聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)A549細(xì)胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用及其機(jī)制[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015， 46（3）：355-358.

[12] Wong VK，Zhang MM，Zhou H，et al. Saikosaponin-d enhances the anticancer potency of TNF-α via overcoming its undesirable response of activating NF-Kappa B Signalling in cancer cells [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，12（12）：85-93.

[13] Lee KJ，Xu MY，Shehzad O，et al. Separation of triterpenoid saponins from the root of Bupleurum falcatum by counter current chromatography：the relationship between the partition coefficients and solvent system composition [J]. J Sep Sci，2014，37（23）：3587-3594.

[14] 趙大海，陸友金.抑制自噬促進(jìn)培美曲賽對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（5）：664-668.

[15] Shvets E，Elazar Z. Flow cytometric analysis of autophagy in living mammalian cells[J]. Methods Enzy Mol，2009，452（1）：131-141.

[16] Kihara A，Kabeya Y，Ohsumi Y，et al. Beclin -phosphatidylinos-itol3-kinase complex functions at the trans Golgi network [J]. EMBO Rep，2001，2（4）：330-335.

[17] 王月霞，陳敏.自噬性細(xì)胞死亡及其與細(xì)胞凋亡、壞死關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2016，32（10）：1433-1436.

[18] 劉輝，李曉強(qiáng)，朱人大，等.自噬激活如何影響大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡、增殖和周期的變化？[J].中國(guó)組織工程研究，2015，19（1）：67-71.

[19] LiangXH，Kleeman LK，Jiang HH，et al. Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin，a novel Bcl-2-interacing protein [J].J Virol，1998，72（11）：8586-8596.

[20] 段振玲，王贊宏，彭芝蘭.自噬基因Beclin1在SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（9）：7-10.

[21] 張茂娜，湯志杰，陳莉.自噬-凋亡通路在腫瘤靶向治療中的意義[J].腫瘤學(xué)雜志，2014，20（5）：413-418.

（收稿日期：2016-10-15 本文編輯：李岳澤）