劉小霞+夏菁++唐家鋒+周明華+陳地龍+劉澤洪

[摘要]為了研究人參皂苷Rh2對(duì)人白血病細(xì)胞K562的凋亡作用，并從自噬角度來(lái)探討其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用CCK8方法檢測(cè)人參皂苷單體Rh2對(duì)人白血病K562細(xì)胞增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Hoechest染色觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)；吖啶橙和MDC染色觀察Rh2對(duì)細(xì)胞自噬的影響；Western blot和RTPCR檢測(cè)Rh2對(duì)白血病細(xì)胞自噬重要基因的表達(dá)的影響；運(yùn)用自噬抑制劑（3MA）研究自噬對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。CCK8顯示人參皂苷Rh2在低濃度時(shí)能有效抑制白血病細(xì)胞增殖，且其抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性；FCM和Hoechest顯示Rh2能增加細(xì)胞的凋亡和染色質(zhì)呈凋亡形態(tài)改變；吖啶橙和MDC染色發(fā)現(xiàn)Rh2組細(xì)胞的綠色熒光增強(qiáng)，并出現(xiàn)大量酸性自噬小泡；Western blot和RTPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rh2能上調(diào)Beclin1，LC3A，LC3B，激活型Caspase3和pp38的表達(dá)；運(yùn)用細(xì)胞自噬劑（3MA）會(huì)削弱Rh2對(duì)K562的增殖抑制和促凋亡作用。人參皂苷Rh2可能通過(guò)激活磷酸化的p38，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬途徑，從而抑制K562細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡作用。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡

白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。迄今，白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用甚大，復(fù)發(fā)率很高，尤其對(duì)機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。因此，可以從傳統(tǒng)的中藥中尋找天然低毒的藥物來(lái)治療白血病。其中人參Panax ginseng CAMeyer是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價(jià)值[1]。S型人參皂苷單體Rh2[（S）Rh2]是人參中天然活性成分之一，是一種從紅參中分離得到的原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物，其毒性低，相對(duì)分子質(zhì)量小，脂溶性好，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[2]。

目前大家認(rèn)為，細(xì)胞死亡包括3種類型：即壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡，其中，自噬是屬于比較熱門(mén)的Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡方式[3]。細(xì)胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更為主動(dòng)和重要的角色。自噬在腫瘤細(xì)胞起到雙刃劍作用，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞，也可以殺傷腫瘤細(xì)胞[4]。作者選取人紅白血病K562細(xì)胞株作為研究對(duì)象，為了進(jìn)一步弄清楚人參皂苷Rh2對(duì)白血病的藥理作用，并從自噬途徑研究人參皂苷Rh2促進(jìn)人白血病細(xì)胞自噬凋亡機(jī)制，為Rh2應(yīng)用于臨床治療白血病奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1材料

11K562細(xì)胞株人紅白血病K562細(xì)胞株購(gòu)自上海ATCC細(xì)胞庫(kù)。每次取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞以5×108個(gè)/L接種于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d傳代或換液。

12藥品Rh2購(gòu)自成都曼斯特科技有限公司（純度98%），取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

13試劑胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin VPI雙標(biāo)凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制劑（美國(guó)Sigma公司）；MAPK通路抗體試劑盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology）；Bcl2，Bax多克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司）。

14儀器超凈工作臺(tái)（Sanyo）；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）；低溫離心機(jī)（Sigma）；酶標(biāo)儀，垂直電泳儀，電轉(zhuǎn)儀，ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，PCR儀（BioRad）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

2方法

21CCK8 法培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，以1×104 個(gè)/孔接種于96孔板中。分為空白對(duì)照組、藥物組和本底對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL，（S）Rh2 20～100 μmol·L-1；本底對(duì)照組：只加RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8檢測(cè)液，輕輕搖勻，孵育25 h 后，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)450 nm）檢測(cè)每孔吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

22FCM檢測(cè)早期凋亡培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別至5×108 個(gè)/L，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分為4組：Ⅰ組為空白對(duì)照組，正常培養(yǎng)；Ⅱ組加入（S）Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ組加入5 mmol·L-1的自噬抑制劑3MA；Ⅳ組同時(shí)加入（S）Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24，48 h后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷001 mol·L-1PBS（pH 72）洗滌2次，4 ℃ 1 200 ×g離心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶（PI） 和Annexin V，置于冰上染色處理30 min，每組細(xì)胞2×104個(gè)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

23Hoechst染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×108 個(gè)/L，接種于6孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組含01% DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)液；藥物組60 μmol ·L-1的Rh2培養(yǎng)48 h后，收集空白對(duì)照組和藥物組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加甲醇乙醇（3∶1）固定液室溫固定15 min；離心去除固定液加Hoechst染色液避光、室溫染色30 min，PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞濃度，滴片，熒光顯微鏡下觀察。

24吖啶橙染色K562細(xì)胞用人參皂苷（S）Rh2 60 μmol·L-1處理24 h后，收集細(xì)胞，新選配制的吖啶橙（2 μ·mL-1），37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度，取一滴細(xì)胞懸液滴到玻片上，待細(xì)胞沉積到玻片上時(shí)，吸去上層液體，封片置于熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、采圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

25Western blot取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×108 個(gè)/L，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組和藥物組（S）Rh2（20，40，60 μmol·L-1），置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。提取蛋白并將各組蛋白濃度調(diào)成4 g·L-1，沸水中煮沸5 min，蛋白完全變性后，冷卻，每個(gè)樣品取10 μL加入泳道中，保證每孔中有40 μg待測(cè)蛋白樣品，行SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入抗體MAPK信號(hào)通路抗體按1∶500稀釋；Bcl2，Bax，Caspase3（激活型），LC3A和LC3B按1∶1 000稀釋抗體，及Beclin1和βactin按1∶2 000稀釋抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；分別加入以1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；最后在保鮮膜上滴入ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室進(jìn)行X膠片曝光，洗片，膠片晾干后。掃描膠片，Quantity One軟件定量分析，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

26RTPCR參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Trizol提取細(xì)胞總RNA。采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。應(yīng)用TAKARA的SYBRⅡ試劑，PCR反應(yīng)體系為10 μL。檢測(cè)自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，用目的基因與GAPDH 的起始拷貝數(shù)比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3結(jié)果

31CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制能力藥物組與對(duì)照組比較，人參皂苷（S）Rh2能有效抑制白血病K562細(xì)胞增殖，并呈濃度和時(shí)間依耐性且K562細(xì)胞48 h的IC50為60 μmol·L-1。因此，選擇Rh2（60 μmol·L-1）作為實(shí)驗(yàn)研究最大濃度，見(jiàn)圖1。

32流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡Rh2 （60 μmol·L-1） 處理K562細(xì)胞24 h 后，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果顯示加藥與對(duì)照組比較1）P<005（圖5，6，8同）。

組細(xì)胞早期和晚期凋亡數(shù)量明顯增多，其早期凋亡率分別為（1200±260）%，且隨著濃度的增高，早期凋亡率增高，分別與對(duì)照組（318±052）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；晚期凋亡率分別為（1632±345）%，且隨著濃度的增高，晚期凋亡率增高，分別與空白對(duì)照組（319±073）%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。

33Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡Rh2（60 μmol·L-1）誘導(dǎo)K562細(xì)胞48 h后，用Hoechst染色顯示，細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核碎裂、核邊集的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光較對(duì)照組細(xì)胞強(qiáng)，見(jiàn)圖2，說(shuō)明Rh2能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

34MDC染色觀察細(xì)胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細(xì)胞24 h后，用MDC染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖3，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)后，K562細(xì)胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對(duì)照組綠色的自噬小泡基本看不見(jiàn)，說(shuō)明人參皂苷（S）Rh2能夠增強(qiáng)細(xì)胞自噬。

35吖啶橙染色觀察細(xì)胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細(xì)胞24 h后，用吖啶橙染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)的自噬體，見(jiàn)圖4，細(xì)胞內(nèi)綠色代表酸性自噬小體，紅色代表核仁，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)后，K562細(xì)胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對(duì)照組綠色的自噬小泡基本看不見(jiàn)。

36RTPCR檢測(cè)自噬重要調(diào)控基因的表達(dá)與對(duì)照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)60 μmol·L-1的（S）Rh2作用24 h后，自噬相關(guān)基因（Atg3，Atg5，Atg7，Atg12）在2種細(xì)胞中變化不明顯，而自噬重要調(diào)控基因Beclin1，LC3A，LC3B的表達(dá)卻明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），見(jiàn)圖5。

37Western blot檢測(cè)自噬重要蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度的（S）Rh2作用后，Beclin1，LC3A，LC3B蛋白的表達(dá)水平明顯增高，見(jiàn)圖6。人參皂苷（S）Rh2能在分子水平上增加自噬重要的蛋白和基因的表達(dá)，進(jìn)一步確定了（S）Rh2能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞發(fā)生自噬。

38（S）Rh2通過(guò)自噬抑制細(xì)胞增殖作用CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用自噬抑制劑3MA能輕微降低細(xì)胞活力，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單獨(dú)使用（S）Rh2能明顯降低細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨(dú)加入（S）Rh2組比較，細(xì)胞活力有明顯的回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），說(shuō)明

39（S）Rh2通過(guò)自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞加入自噬抑制劑時(shí)，與對(duì)照組比較無(wú)明顯改變；單獨(dú)使用（S）Rh2時(shí)，細(xì)胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨(dú)加入（S）Rh2組比較，細(xì)胞凋亡有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），說(shuō)明細(xì)胞自噬能增強(qiáng)人參皂苷（S）Rh2對(duì)白血病K562細(xì)胞的促凋亡作用，見(jiàn)表2。

310Western blot檢測(cè)自噬對(duì)（S）Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響單獨(dú)運(yùn)用自噬抑制劑3MA后，細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B有下降的趨勢(shì)，單獨(dú)運(yùn)用（S）Rh2后，細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型的Caspase3表達(dá)明顯上升，當(dāng)同時(shí)加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，細(xì)胞的自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型Caspase3的表達(dá)比單獨(dú)運(yùn)用（S）Rh2時(shí)明顯下降，說(shuō)明抑制自噬后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減少，自噬可促進(jìn)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)K562的凋亡作用，見(jiàn)圖7。

與對(duì)照組比較1）P<005，與Rh2組比較2）P<005。

311Rh2通過(guò)激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡10，20，40，60 μmol·L-1Rh2 作用于K562細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示，p38蛋白的表達(dá)幾乎沒(méi)變化，pp38的表達(dá)增加，提示Rh2可能通過(guò)激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡，見(jiàn)圖8。

4討論

目前，許多研究者認(rèn)為自然界中有豐富抗腫瘤的天然藥物，本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明人參提取物人參總皂苷和單體能在體外抑制白血病和肝癌細(xì)胞增殖，阻滯周期，促進(jìn)凋亡。其他國(guó)內(nèi)外研究人員也研究證實(shí)，人參皂苷單體能抑制各種腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[56]。因此采用CCK8法研究人參皂苷單體Rh2對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能有效抑制白血病細(xì)胞的增長(zhǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，Hoechst染色同樣證明了Rh2能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rh2能夠

增加Bax/Bcl2的比例，同時(shí)激活Caspase3，說(shuō)明了Rh2能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞自噬和凋亡密切相關(guān)，凋亡的早期，細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)自噬。為了探討人參皂苷（S）Rh2對(duì)白血病細(xì)胞自噬的關(guān)系，運(yùn)用了吖啶橙和MDC染色。發(fā)現(xiàn)加藥組早期細(xì)胞出現(xiàn)酸性的自噬泡，PCR和Western blot結(jié)果顯示自噬相關(guān)基因和蛋白分子（Beclin1，LC3A和LC3B）的表達(dá)均升高，證明了人參皂苷（S）Rh2能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬。 自噬異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以從不同生物學(xué)行為影響腫瘤的進(jìn)程，其中有細(xì)胞周期、增殖、凋亡、耐藥、血管生成及腫瘤的治療等方面的調(diào)控[7]。文獻(xiàn)研究報(bào)道，自噬和細(xì)胞凋亡的關(guān)系存在兩面性，維持細(xì)胞生存和促進(jìn)細(xì)胞死亡[8]。前面的實(shí)驗(yàn)證明了人參皂苷Rh2既能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡又能誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，那么細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)系是怎樣的呢？實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)同時(shí)加入自噬抑制劑3MA和Rh2時(shí)，與單獨(dú)加入Rh2相比，K562的細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞活力增強(qiáng)。說(shuō)明抑制細(xì)胞自噬，可削弱人參皂苷Rh2對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，提示人參皂苷Rh2可以通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

目前，MAPK信號(hào)通路能調(diào)控自噬和細(xì)胞凋亡[9]。作者前期的研究已經(jīng)證實(shí)人參皂苷Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，3甲基腺嘌呤（3MA）通過(guò)抑制ClassⅢ PI3K 的活性抑制自噬，抑制細(xì)胞自噬可以削弱人參皂苷Rh2對(duì)K562的抑制增殖和促凋亡作用[10]。為了研究人參皂苷Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡的可能機(jī)制，作者運(yùn)用了Western blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵的蛋白p38，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2分別能夠激活p38，發(fā)生磷酸化激活。證明了參皂苷Rh2可能能通過(guò)激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Rokot N T， Kairupan T S， Cheng K C， et al A role of ginseng and its constituents in the treatment of central nervous system disorders [J] Evid Based Complement Alternat Med：eCAM， 2016， 2016：2614742

[2]Jeong M K， Cho C K， Yoo H S General and genetic toxicology of enzymetreated ginseng extract：toxicology of ginseng Rh2 [J]. J Pharmacopuncture， 2016， 19（3）：213

[3]Sbrana F V， Cortini M， Avnet S， et al The role of autophagy in the maintenance of stemness and differentiation of mesenchymal stem cells [J] Stem Cell Rev Rep， 2016，12（6）：621

[4]Duffy A， Le J， Sausville E， et al Autophagy modulation：a target for cancer treatment development [J] Cancer Chemother Pharmacol， 2015， 75（3）：439

[5]Liu X， Sun Y， Yue L， et al JNK pathway and relative transcriptional factor were involved in ginsenoside Rh2mediated G1 growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells [J] Genet Mol Res：GMR， 2016， 15（3）：gmr15039003

[6]Liu Z H， Li J， Xia J， et al Ginsenoside 20（s）Rh2 as potent natural histone deacetylase inhibitors suppressing the growth of human leukemia cells [J] Chem Biol Interact， 2015， 242：227

[7]Zhang D， Tang B， Xie X， et al The interplay between DNA repair and autophagy in cancer therapy [J] Cancer Biol Ther， 2015， 16（7）：1005

[8]Helgason G V， Holyoake T L， Ryan K M Role of autophagy in cancer prevention， development and therapy [J] Essays Biochem， 2013， 55：133

[9]Ge J， Liu Y， Li Q， et al Resveratrol induces apoptosis and autophagy in Tcell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38MAPK [J] Biomed Environ Sci：BES， 2013， 26（11）：902

[10]Wu J C， Lai C S， Badmaev V， et al Tetrahydrocurcumin， a major metabolite of curcumin， induced autophagic cell death through coordinative modulation of PI3K/AktmTOR and MAPK signaling pathways in human leukemia HL60 cells [J] Mol Nutr Food Res， 2011， 55（11）：1646

[責(zé)任編輯張寧寧]