（文昌市人民醫(yī)院泌尿外科，海南文昌 571000）

Mechanism of calcium oxalate kidney stone formation mediated by autophagy and endoplasmic reticulum stress pathway regulated by p38 MAPK pathway

XIE Yabin，WANG Fei，WANG Kangyang，LIN Shishuai

（Department of Urology，Wenchang People’s Hospital，Wenchang 571000，China）

ABSTRACT：Objective To explore the effects and mechanism of p38 mitogen activated protein kinase （MAPK） pathway on the formation of calcium oxalate （CaOx） kidney stones in rats，so as to provide new ideas for the treatment of kidney stones.

Methods A total of 40 rats were divided into control，SB203580，CaOx and SB203580+CaOx groups，with 10 rats in each group.Intragastric administration of a mixture of 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride was given to the CaOx and SB203580+CaOx groups to construct CaOx models，while intragastric administration of drinking water was given to the control and SB203580 groups.After molding，SB203580 and SB203580+CaOx groups were injected with 5 mg/kg SB203580 peritoneally once a day for 14 days，while the control and CaOx groups were injected with equal volume of normal saline.The renal mass of rats was measured and the renal coefficient was calculated；the serum levels of blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （SCr） were measured with an automated biochemical analyzer；the urinary levels of neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein （NGAL） and kidney injury molecule-1 （KIM-1） were determined with enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）；the crystal deposition and tissue damage in renal tissues were observed with Von Kossa staining；the apoptosis of renal tubule cells was observed with TUNEL；the expressions of autophagy markers in kidney tissues were detected with immunohistochemical staining；the molecular expressions of autophagy-endoplasmic reticulum stress related pathways in renal tissues were determined with RT-qPCR and Western blot.Results Compared with the CaOx group，the SB203580+CaOx group had increased body mass after molding （Plt;0.05）；decreased kidney mass，kidney coefficient，BUN，SCr，NGAL and KIM-1 levels （Plt;0.05）；alleviated pathological damage of kidney tissues；significantly reduced black crystal；down-regulated proportion of positive TUNEL cells，positive expression area of LC3B and Beclin-1，mRNA expressions of LC3B，Beclin-1，CHOP and GRP78，protein ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，and protein expressions of Beclin-1，CHOP and GRP78 （Plt;0.05）；but up-regulated mRNA and protein expressions of p62 （Plt;0.05）.Conclusion The p38 MAPK pathway is involved in the formation of CaOx kidney stones in rats.Inhibition of this pathway can reduce the formation of kidney stones，which may be related to the regulation of autophagy and endoplasmic reticulum stress.

KEY WORDS：kidney stone；calcium oxalate；p38 mitogen activated protein kinase；autophagy；endoplasmic reticulum stress；

kidney stone formation；animal models of kidney stone

收稿日期：2023-03-14 """修回日期：2023-09-25

基金項目：海南省衛(wèi)生健康行業(yè)科研項目（No.22A200166）

通信作者：王飛，主任醫(yī)師。E-mail：hnsywangfei@163.com

作者簡介：謝亞彬，碩士研究生，副主任醫(yī)師。研究方向：泌尿系結石。E-mail：avene00@163.com

摘要：目的 探究p38 MAPK通路對大鼠草酸鈣（CaOx）腎結石形成的影響及其作用機制，為腎結石的治療選擇提供新的思路。方法 將40只大鼠分為對照組、SB203580組、CaOx組、SB203580+CaOx組，每組10只，CaOx組和SB203580+CaOx組以1%乙二醇與1%氯化銨配制的混合液灌胃建立CaOx腎結石模型，對照組和SB203580組以飲用水灌胃；造模后，SB203580組和SB203580+CaOx組腹腔注入劑量為5 mg/kg的SB203580，1次/d，連續(xù)注射14 d，對照組和CaOx組腹腔注入等體積生理鹽水。稱量大鼠腎臟質量并計算腎臟系數，全自動生化分析儀檢測血清中血清尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）水平，酶聯免疫吸附法（ELISA）測定尿液中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）和腎損傷分子-1（KIM-1）水平，鈣鹽染色（Von Kossa）觀察黑色晶體沉積及組織損傷情況，原位末端標記法（TUNEL）觀察腎小管細胞凋亡情況，免疫組化染色檢測自噬標記物表達，實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）與蛋白質印跡（Western blotting）測定自噬及內質網應激途徑相關分子表達。結果 與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠造模后體質量較高（Plt;0.05），腎臟質量、腎臟系數、BUN、SCr、NGAL、KIM-1水平均較低（Plt;0.05），腎臟組織病理損傷減輕且黑色結晶明顯減少，TUNEL陽性細胞比例、LC3B與Beclin-1陽性表達面積占比、LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值、Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白表達均下調（Plt;0.05），p62 mRNA和蛋白表達上調（Plt;0.05）。結論 p38 MAPK通路參與大鼠CaOx腎結石形成，抑制該通路能夠減少腎結石形成，該作用可能與其調控自噬-內質網應激有關。

關鍵詞：腎結石；草酸鈣；p38絲裂原激活蛋白激酶；自噬；內質網應激；結石形成；腎結石動物模型中圖分類號：R692.4 ""文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.01.015""腎結石為泌尿系常見疾病，多發(fā)生于腎盞、腎盂及腎盂與輸尿管連接部［1］。據報道，腎結石的患病率和發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢，我國成年人腎結石的患病率達到5.8%［2］。多種環(huán)境因素如生活方式、飲食習慣、地域差異等，均影響腎結石的形成［3］，而其發(fā)病機制目前仍不明確。草酸鈣（calcium oxalate，CaOx）結石是常見的腎結石類型，大約占所有腎結石病例的80%，主要由于攝入含草酸較高的食物導致體內草酸大量積累形成。

有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，可響應不同刺激將信號從細胞膜傳遞到細胞核，常見的3種同工酶包括c-Jun氨基末端激酶、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶及p38絲裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK）。p38 MAPK通路在腎結石形成過程中發(fā)揮著重要作用，但其具體作用模式及機制有待進一步明確［4-7］?；诖?，本研究通過建立CaOx腎結石大鼠模型，使用p38 MAPK通路抑制劑SB203580對該通路活性進行調節(jié)，來研究p38 MAPK通路是否在CaOx腎結石形成過程中調節(jié)自噬-內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應，以期闡明p38 MAPK通路參與腎結石形成的作用機制，為腎結石治療提供更多的選擇思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由海南藥物研究所有限責任公司提供。將大鼠飼養(yǎng)在動物實驗中心實驗室內，溫度為22～25 ℃，相對濕度為50%～60%，明暗周期各12 h，每5只大鼠同籠飼養(yǎng)，期間自由進食、飲水。本研究經我院動物倫理委員會批準實施［2022論審（03-5）號］。

1.2 主要試劑 p38 MAPK抑制劑SB203580（上海吉至生化科技有限公司），乙二醇和氯化銨（北京普非生物科技有限公司），血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）檢測試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），尿液中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein，NGAL）、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），鈣鹽染色（Von Kossa） 試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），原位末端標記法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料、山羊血清、DAB顯色試劑盒及ECL試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），第一鏈cDNA合成試劑盒和實時熒光定量擴增試劑盒（南京諾唯贊生物公司），RIPA裂解液（武漢博士德生物工程有限公司），BCA蛋白檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司），兔抗LC3B多克隆抗體、兔抗Beclin-1多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體、兔抗CHOP多克隆抗體、兔抗GRP78多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（英國Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗分組與造模、給藥

按照隨機分組原則將40只大鼠分為對照組、SB203580組、CaOx組、SB203580+CaOx組，每組10只。分籠飼養(yǎng)1周后，對照組和SB203580組的大鼠采用飲用水喂養(yǎng)，CaOx組和SB203580+CaOx組的大鼠每日以體積分數為1%乙二醇與1%氯化銨配制的混合液灌胃，2 mL/d，連續(xù)4周，以復制建立CaOx腎結石大鼠模型［8］。造模后，SB203580組和SB203580+CaOx組通過腹腔注入劑量為5 mg/kg的SB203580，1次/d，連續(xù)注射14 d，與此同時，對照組和CaOx組注入等體積生理鹽水。

1.3.2 大鼠體質量、腎臟質量及腎臟系數測定 實驗前，將各組大鼠置于校準后的電子天平上稱重、記錄。實驗后，再次稱量并記錄。解剖大鼠取腎臟組織，將腎包膜剝離干凈后，電子天平上稱量雙側腎質量并記錄，計算腎臟系數，計算公式：臟器系數＝臟器質量（g）/大鼠體質量（100 g）。

1.3.3 大鼠腎功能相關指標檢測 采用無菌采血針頭經下腔靜脈分別抽取各組大鼠3 mL血液置于離心管內，通過離心機以3 000 轉/min的速度離心15 min后，微量移液器取上清液即血清移入潔凈離心管中保存。從代謝籠里收集大鼠24 h尿液，移入離心管后再通過離心機以1 200 轉/min的速度離心15 min，收集上清液備用。用全自動生化分析儀檢測血清中BUN和SCr水平，酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定尿液中腎小管損傷標志物NGAL和KIM-1水平。

1.3.4 Von Kossa染色

將腎臟組織用生理鹽水清洗干凈，浸入4%多聚甲醛溶液固定過夜。修剪組織塊，石蠟包埋，并制作組織切片。切片經脫蠟水化后，將配制好的Von Kossa染色工作液滴加到切片上，至標本被染液完全覆蓋，在濕盒內孵育45 min。隨后蒸餾水清洗切片，滴加蘇木素染色5 min，清水沖洗，用體積分數為1%的鹽酸酒精分化數秒，水洗返藍，再滴加伊紅染色2 min，流水沖洗多余染液，中性樹膠封固，使用光學顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.5 TUNEL染色

將腎臟組織石蠟切片進行脫蠟水化，蒸餾水清洗，將配置好的蛋白酶K工作液滴加在切片上，放于濕盒內并置于37 ℃恒溫箱內孵育20 min。結束后，采用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗切片，在切片上滴加TUNEL檢測液將樣本組織完全覆蓋，繼續(xù)放于濕盒內避光孵育1 h。PBS洗掉多余染液，接著將DAPI染液均勻滴加到切片上，室溫下避光染核10 min。PBS再次清洗，抗熒光淬滅劑密封，通過熒光顯微鏡觀察并采集圖像。每張切片隨機選3個不重疊視野，計數視野下TUNEL標記的陽性數目（即死亡細胞）與總細胞數目，以兩者之比記為TUNEL陽性細胞率。

1.3.6 免疫組化染色 將腎臟組織石蠟切片進行脫蠟水化，PBS清洗，放入pH值為6.0的枸櫞酸鉀溶液中，微波爐加熱修復抗原后，取出冷卻至室溫，PBS清洗后，用體積分數為3%的H2O2孵育15 min，再用體積分數為10%山羊血清室溫封閉30 min。分別將稀釋的兔抗LC3B多克隆抗體（1∶200）、兔抗Beclin-1多克隆抗體（1∶200）滴加至切片上，置4 ℃孵育過夜。次日將切片取出復溫，棄多余溶液，PBS清洗后，滴加對應稀釋后的二抗（1∶1 000），置37 ℃恒溫箱孵育30 min。PBS充分清洗后，將配置好的DAB顯色液滴于切片上，室溫孵育5 min，蘇木精復染，體積分數為1%的鹽酸酒精分化數秒，常規(guī)脫水與透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察并采集圖像。鏡下有黃棕色至棕色染色即為陽性，每張切片隨機選3個不重疊視野，通過Image-Pro Plus軟件分析LC3B與Beclin-1的陽性表達情況。

1.3.7 定量聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法

腎臟組織剪碎放入研缽，倒入液氮迅速研磨至粉末狀，再迅速移入無酶離心管，Trizol法提取總RNA，分光光度計測量RNA濃度及純度。取RNA樣品，將其逆轉錄產生cDNA，根據第一鏈cDNA合成試劑盒操作。依RT-qPCR試劑盒說明配制反應體系，在基因定量測定儀器上擴增，反應程序設置為：95 ℃ 10 min，1次循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40次循環(huán)，可根據情況調整。擴增后，采用比較循環(huán)閾值2-ΔΔCt法統(tǒng)計各基因的相對表達量，引物序列見表1。

1.3.8 蛋白質印跡（Western blotting）實驗

將腎臟組織剪碎后放入研缽內，倒入液氮迅速研磨至粉末狀，添加RIPA裂解液置于冰上充分裂解。通過低溫離心機12 000 轉/min離心20 min，收集上清液并根據BCA法測定蛋白樣品濃度。取一定量蛋白與上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱變性5 min。制備分離膠與濃縮膠，安裝固定好電泳裝置，將變性后的30 μg蛋白等量上樣至凝膠孔內，電泳分離后再轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。將膜與稀釋好的一抗（1∶1 000）共置于4 ℃下孵育過夜。次日，TBST清洗膜，再將其與稀釋好的對應二抗（1∶5 000）置于室溫下共孵育2 h，TBST再次洗膜，在膜面上滴加ECL溶液，使試劑與膜充分接觸，避光孵育5 min。放入蛋白成像系統(tǒng)中采集圖像，以GADPH蛋白作為內參，通過Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行實驗數據統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.30軟件繪制統(tǒng)計圖。計量資料以（x±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 四組大鼠造模前后體質量變化及腎臟質量、腎臟系數比較

通過對四組大鼠造模前后體質量進行統(tǒng)計發(fā)現，造模前四組大鼠體質量之間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。而在造模后，與對照組大鼠體質量

比較，CaOx組較低（Plt;0.05），SB203580組差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠體質量較高（Plt;0.05，表2）。此外，與對照組比較，CaOx組大鼠腎臟質量和腎臟系數均較高（Plt;0.05），SB203580組差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠腎臟質量和腎臟系數均顯著下降（Plt;0.05，表2）。

2.2 四組大鼠血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平比較

四組大鼠血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平的檢測結果顯示，與對照組比較，CaOx組血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均顯著升高（Plt;0.05），SB203580組以上指標與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均較低（Plt;0.05，表3）。

2.3 四組大鼠腎臟組織內草酸鈣結晶形成情況比較

Von Kossa染色觀察四組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學變化，可見對照組和SB203580組腎臟組織中未見黑色晶體（即結石），而CaOx組腎小管管腔內有大量彌漫性結晶分布；相較于CaOx組，SB203580+CaOx組腎臟組織內黑色結晶明顯減少（圖1）。

A：對照組；B：SB203580組；C：CaOx組；D：SB203580+CaOx組。

2.4 四組大鼠腎臟內細胞凋亡情況比較四組大鼠腎臟組織內綠色標記細胞為TUNEL陽性染色，即代表細胞凋亡情況。與對照組比較，CaOx組腎臟組織內TUNEL陽性細胞比例顯著增加（Plt;0.05），而SB203580組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織內TUNEL陽性細胞比例顯著減少（Plt;0.05，圖2）。

TUNEL：原位末端標記法；Merge：合并；DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。

2.5 四組大鼠腎臟組織LC3B與Beclin-1陽性染色比較

免疫組化染色觀察腎臟組織內LC3B與Beclin-1表達，與對照組比較，CaOx組腎臟組織內LC3B與Beclin-1陽性表達面積占比顯著升高（Plt;0.05），而SB203580組中兩種蛋白陽性表達面積占比與對照組差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織內LC3B與Beclin-1陽性表達面積占比較?。≒lt;0.05，圖3）。

A：LC3B在腎臟組織中的免疫組化染色結果（×100）；B：Beclin-1在腎臟組織中的免疫組化染色結果（×100）；C：四組腎臟組織LC3B陽性表達面積占比統(tǒng)計圖；D：四組腎臟組織Beclin-1陽性表達面積占比統(tǒng)計圖；與對照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

2.6 四組大鼠腎臟組織自噬-內質網應激相關分子在mRNA水平上的表達比較

RT-qPCR測定四組大鼠腎臟組織自噬相關分子LC3B、Beclin-1、p62 mRNA及內質網應激相關分子CHOP、GRP78 mRNA的表達變化。與對照組比較，CaOx組腎臟組織中LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA相對表達量均顯著上調（Plt;0.05），p62 mRNA相對表達量顯著下調（Plt;0.05），SB203580組上述各基因表達量與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織中LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA相對表達量均顯著下調（Plt;0.05），而p62 mRNA相對表達量顯著上調（Plt;0.05，圖4）。

①對照組；

②SB203580組；

③CaOx組；

④SB203580+CaOx組；A：四組腎臟組織LC3B mRNA表達統(tǒng)計圖；B：四組腎臟組織Beclin-1 mRNA表達統(tǒng)計圖；C：四組腎臟組織p62 mRNA表達統(tǒng)計圖；D：四組腎臟組織CHOP mRNA表達統(tǒng)計圖；E：四組腎臟組織GRP78 mRNA表達統(tǒng)計圖；與對照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

Western blot測定結果同樣顯示，與對照組比較，CaOx組腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值顯著升高（Plt;0.05），Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白相對表達量顯著上調（Plt;0.05），p62蛋白相對表達量顯著下調（Plt;0.05），SB203580組上述各蛋白表達量與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值顯著降低（Plt;0.05），Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白相對表達量顯著下調（Plt;0.05），而p62蛋白相對表達量顯著上調（Plt;0.05，圖5）。

①對照組；

②SB203580組；

③CaOx組；

④SB203580+CaOx組；A：Western blot電泳結果；B：四組腎臟組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值統(tǒng)計圖；C：四組腎臟組織Beclin-1蛋白表達統(tǒng)計圖；D：四組腎臟組織p62蛋白表達統(tǒng)計圖；E：四組腎臟組織CHOP蛋白表達統(tǒng)計圖；F：四組腎臟組織GRP78蛋白表達統(tǒng)計圖。與對照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

3 討 論

CaOx腎結石可誘發(fā)腎臟炎癥反應，導致腎小管上皮細胞壞死。使用不同濃度梯度CaOx處理人腎小管上皮細胞后，隨著處理濃度的增加或處理時間的延長，腎小管上皮細胞的存活率逐漸降低，細胞形態(tài)明顯損傷［9］。在晶體形成的初始階段，高水平的草酸鹽暴露可能會損害腎小管上皮細胞并引起氧化應激，產生大量活性氧，進而引起一系列的細胞內反應，促使晶體沉淀并粘附在細胞膜上［10］。由此可見，腎小管上皮細胞的損傷是CaOx腎結石形成的重要原因。因此，明確CaOx腎結石形成的病理分子機制對于根治腎結石及預防結石的形成至關重要。

以往研究表明，在實驗動物模型與CaOx腎結石患者腎臟內，聚集、粘附在腎小管上皮細胞上的晶體能夠滲入到腎間質中，誘導大量炎性細胞聚集，同時這些炎性細胞還能夠分泌炎性因子，進而促進腎小管上皮細胞損傷，最終導致腎結石的形成［11-12］。由此可見，腎間質內炎癥反應是CaOx腎結石的重要發(fā)病機制，然而，CaOx誘導腎臟炎癥反應的具體分子機制卻尚未闡明。p38 MAPK是一種細胞內信號轉導途徑，參與促炎介質的產生，阻斷該信號通路可以抑制炎癥反應。先前研究表明，CaOx腎結石形成過程中p38 MAPK信號通路相關蛋白的表達水平上調［13］，由此推測，p38 MAPK信號通路可能參與CaOx腎結石形成。QI等［14］研究指出p38 MAPK信號通路介導草酸鈣一水合物晶體誘導大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E內晶體粘附變化；GUZEL等［15］研究表明高草酸尿癥大鼠中p38 MAPK信號通路激活，這促進了腎臟中草酸鹽結石形成的氧化過程；張智源等［16］研究發(fā)現在大鼠CaOx腎結石形成過程中p38 MAPK信號通路被激活，而使用金錢草提取物能夠抑制p38 MAPK通路從而抑制腎結石形成。以上結果提示，抑制p38 MAPK通路激活可作為抑制CaOx腎結石形成進展的一項干預措施。因此，本研究選擇p38 MAPK抑制劑來阻斷該通路，探究這一作用是否對腎結石產生影響。SB203580是p38 MAPK的選擇性抑制劑，通過與ATP競爭結合ATP結合口袋內部或附近的非保守區(qū)域，抑制p38 MAPK活性，目前已在各種動物模型研究中廣泛使用［17］。本研究結果顯示，較CaOx組，經過SB203580處理的CaOx腎結石模型大鼠體質量較高，腎臟質量和腎臟系數較低，血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均下降，此外，腎臟組織內黑色晶體沉積明顯減少，凋亡細胞數目也減少，這說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性能夠減少大鼠CaOx腎結石形成，并保護其腎功能。

自噬是一種高度保守且嚴格調控的細胞事件，能夠從細胞中去除受損或老化的細胞器以及錯誤折疊或聚集的蛋白質，維持細胞正常代謝和穩(wěn)態(tài)［18］。自噬相關蛋白Beclin-1是一組進化保守的蛋白質，通過形成自噬體的雙膜結合結構來介導自噬功能。此外，LC3I通過半胱氨酸蛋白酶Atg3和Atg5參與的泛素樣反應，進而轉化為脂質化形式的LC3-Ⅱ，附在膜上以作為自噬體的結構蛋白［19］。研究表明，在高尿酸血癥、缺血、順鉑誘導的腎臟損傷中，自噬增強能夠防止或減緩組織損傷［20-22］。然而，在CaOx腎結石中通過某些途徑激活自噬會加劇腎臟損傷，如高鈣尿癥和高草酸尿癥會增加細胞自噬并導致腎結石的形成，而自噬上調會加重氧化應激、細胞凋亡等反應，進一步促進腎臟損傷［23］。因此，抑制自噬可能是CaOx腎結石的新治療策略。本研究檢測結果表明，經過SB203580處理的CaOx腎結石模型大鼠腎臟組織內LC3B與Beclin-1陽性表達面積占比下降，LC3B mRNA相對表達量下調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值降低，Beclin-1 mRNA和蛋白相對表達量下調，p62 mRNA和蛋白相對表達量上調，這一結果說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性，抑制CaOx腎結石模型大鼠腎臟組織內細胞自噬水平，這可能是發(fā)揮其保護CaOx腎結石模型大鼠的重要機制。

內質網在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。當內源性或外源性刺激包括缺乏分子伴侶或細胞能量、Ca2+缺乏、二硫鍵還原、蛋白質突變和氧化還原穩(wěn)態(tài)時，內質網中的折疊蛋白功能紊亂，大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質積聚在腔內，并引起一系列后續(xù)反應，稱為ERS［24］。研究表明，草酸鹽的長期積累可誘導腎小管上皮細胞的ERS，促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生過多，ROS水平升高可導致腎小管上皮細胞變性、凋亡和壞死，使得基底膜暴露，從而引發(fā)CaOx腎結石中的晶體成核、聚集和生長［25］。GRP78是一種內質網伴侶蛋白，在內質網膜中與激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇需要酶1α（inositol requiring enzyme 1α，IRE1α）和胰腺ER激酶（pancreatic ER kinase，PERK）相互作用，使這些跨膜蛋白保持在非活性配置中［26］。未折疊蛋白質反應通過內質網相關降解和溶酶體介導的自噬消除錯誤折疊或未折疊的蛋白質，從而協助蛋白質合成。然而，當未折疊蛋白質反應不能管理錯誤折疊和未折疊的蛋白質時，細胞凋亡途徑被觸發(fā)，ERS常通過CHOP途徑誘導細胞凋亡［27］。由此可見，ERS及其伴隨的細胞自噬與CaOx腎結石的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究檢測結果表明，經過SB203580處理的CaOx腎結石模型大鼠腎臟組織內CHOP、GRP78 mRNA與蛋白相對表達量均明顯下調，由此說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性降低了CaOx腎結石模型大鼠腎臟組織內ERS反應，進而抑制CaOx腎結石模型大鼠病理進程。

綜上所述，本研究結果表明p38 MAPK參與大鼠CaOx腎結石形成，采用p38 MAPK抑制劑SB203580直接作用CaOx腎結石大鼠能夠減輕腎臟功能損害，減少腎臟組織內黑色晶體沉積與腎小管細胞凋亡，該保護機制可能與調節(jié)自噬-ERS途徑有關。本研究從經典激酶途徑闡明腎結石形成和發(fā)展的機制，為CaOx腎結石的預防和治療提供理論依據，但關于使用SB203580的生物安全性評價還需后續(xù)進一步論證。此外，在CaOx腎結石形成中，進一步激活p38 MAPK是否對CaOx腎結石形成發(fā)揮促進作用，也有待后續(xù)探究。

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（編輯 郭楚君）